UV transiluminátor: Výběr a použití správného systému pro gelovou vizualizaci

problémem je UV transiluminátor. Čte DNA, RNA nebo proteinové pásy jednoduchým způsobem, tedy tím, že propusťuje ultrafialové světlo přes obarvený gel. Operátor pak může gel prohlédnout, vyfotit ho nebo vyříznout požadovaný pás, aby s ním později pracoval.

Většina problémů se týká i jiných věcí než vypínače. Tyto problémy jsou způsobeny nesprávnou vlnovou délkou, nekompatibilním osvětlením a skvrnami, příliš dlouhou expozicí a nedostatkem UV ochrany.

Dobrý pracovní postup UV transiluminátoru by měl poskytovat čisté pásy, přičemž pouze minimální expozice vzorku a osoby používající přístroj.

Jak funguje UV transiluminátor

Gel je poté elektroforován, přičemž zůstává molekulární fragmenty, které obvykle nejsou viditelné pouhým okem. Fluorescenční mořidlo, které se přichytí nebo interaguje s materiálem, který má být mořil. Obarvený gel se poté přenese na osvětlený povrch a barvivo je excitováno ultrafialovým světlem a vytváří fluorescenci viditelnou okem.

Tmavé pozadí a jasné pásy umožňují přiblížit velikost fragmentů, porovnat intenzitu vzorků, zkontrolovat amplifikační produkty nebo najít materiál pro extrakci gelu.

Existuje několik UV transiluminátorů dostupných na standardních vlnových délkách 254, 302 a 365 nm. Některé nabízejí jednu vlnovou délku, jiné dvě nebo tři; Který je nejlepší, závisí na typu nástroje a požadované vlnové délce. Aplikace pro pozorování gelu a elektroforézu využívají široké spektrum UV v blízkosti 302 nm.

Vyberte vlnovou délku pro skutečnou aplikaci

Intenzita fluorescence, poškození vzorku a kompatibilita barvení jsou ovlivněny výběrem vlnové délky.

Při pozorování fluorescenčně barvených DNA a RNA gelů se často používá zdroj o délce 302 nm, protože obvykle poskytuje vysoce intenzivní signál a s tímto zdrojem lze použít mnoho známých nukleových kyselinových barviv. Jednoduché řešení pro rutinní kontroly gelu a dokumentaci.

Pokud je snížení poškození DNA způsobeného UV zářením důležitější než nejsilnější možný signál, lze zvážit použití dlouhovlnného UV, které je blízko 365 nm. Thermo Fisher doporučuje minimalizovat expozici DNA a doporučuje použití delší vlnové délky (přibližně 360 nm), pokud bude DNA z gelu získána.

Použití krátkovlnného UV (blízko 254 nm) pro rutinní sledování DNA-gelů by nemělo být považováno za automatické, ačkoli některé laboratorní transiluminátory jsou k dispozici. Je vhodný k použití v závislosti na zářivkovém materiálu a použití v laboratoři.

Největší vlnová délka tedy není nejefektivnější možností. Je to ta, která ladí s barvou a dostatečně udrží vzorek pro další krok.

Pro světelný zdroj jiné barvy použijte jinou barvu gelového mořidla

Transiluminátor a gelové moření by měly být považovány za jeden optický systém.

Existují různé typy barviv s odlišnými charakteristikami excitace a emise. Skvrna může mít vysokou UV odrazivost a nízkou odrazivost modrého světla, a naopak. Filtr kamery by měl také umožnit průchod vyzařované fluorescence a zabránit průchodu nežádoucího excitačního záření.

Před novým testem:

• Vlnové délky, které barvu vzrušují, jsou lequel. Vlnové délky, které barvu vzrušují, jsou 'luequels'.
• Rozhodnutí o použití fotografického filtru určí konkrétní fotograf.
• Vlastnosti barvicí látky (DNA, RNA nebo protein)
• Jestli se gel má řezat nebo ne, jak to bude dokumentováno?
• Pokud je zdroj světla nová technologie, existuje nějaká metoda, jak ho zachytit pomocí současného zobrazovacího systému?

Například SYBR Safe barvené gely lze zobrazit pomocí vhodného fluorescenčního zařízení s UV nebo modrým světelným filtrem – filtr používaný pro zobrazování ethidi-bromidu nemusí být vhodný.

Pokud je obraz příliš slabý, neznamená to nutně, že je v gelu málo DNA. Příčinou může být nevhodná vlnová délka excitace, špatný filtr fotoaparátu, použité zastaralé UV lampy nebo příliš mnoho místního světla.

Pokud se poškození DNA obnoví, omezte vystavení UV záření

Nukleové kyseliny jsou náchylné k poškození UV zářením. To je významné, pokud chce výzkumník extrahovat DNA pás z gelu a využít zbývající DNA v dalších aplikacích, jako je klonování, ligace, sekvenování nebo jiné aplikace.

Dlouhá expozice může vést k poškození DNA i dalším poškozením, což může ovlivnit kvalitu získané DNA. Dlouhodobé vystavení UV záření může vést k poškození DNA, což by mohlo ovlivnit další aplikace, jako je subklonování, upozorňuje Thermo Fisher.

V případě, že je potřeba vizualizace UV:

1. Před rozsvícením světla nastavte řezné nástroje a sběrnou trubici.
   1. Nastavte nejnižší nastavení, které vytvoří průhledný pás.
   1. Expozice by měla být minimalizována.
   1. Pokud je to možné, představte si delší vlnovou délku UV světla.
   1. Nesledujte opakovaně stejný gel.
   1. Poznamenejte si zvolené pásmo a vypněte zdroj.

Modrosvětelný transiluminátor kompatibilní s klonováním může být vhodnější pro obzvlášť citlivou klonovací práci. Barvy mohou být excitovány modrým světlem a bylo zjištěno, že modré světlo způsobuje DNA menší poškození.

Zkontrolujte jednotnost osvětlení

Transiluminátor by měl zajistit rovnoměrné osvětlení oblasti, která má být pozorována.

Pokud je jedna strana povrchu intenzivnější než druhá, budou stejné pásy s různou intenzitou v závislosti na jejich umístění na gelu. To je zvláště důležité, když jsou dráhy porovnávány ve stejné laboratoři a/nebo když se používá obraz pro polokvantitativní analýzu.

Jednotnost je ovlivněna stavem lamp, uspořádáním lamp, filtry, čistotou povrchů a optickým designem přístroje. Jednotné osvětlení je v kontextu UVP důležité pro dosažení opakovatelnosti výsledků v různých pásmech a drahách.

Vždy zkontrolujte pozadí, zda je rovnoměrné v celém gelu, než se zaměříte na intenzitu pásku. Přenos stejného gelu na jinou část povrchu může pomoci vyvinout problém s osvětlením.

Použijte správnou oblast pro sledování

Plocha, kde je povrch osvětlen, by měla být dostatečná k pokrytí gelu, ale nezabírala by žádné místo na stole.

Malá buňka je skvělá pro standardní mini-gely. Větší platformy budou lepší pro velkoformátové gely nebo více gelů vedle sebe. Existují komerční systémy s různými osvětlenými plochami, obvykle o rozměrech asi 20 x 20 cm a více.

Celý gel by měl být na povrchu plochý. Odrazy a rozmazání pásků jsou možné kvůli záhybům v ochranné fólii, příliš velkému pufru nebo nerovné misie.

Zajistěte čistý výhled; Používejte pouze materiály a čisticí prostředky kompatibilní s UV filtrem. Snímky mohou být ovlivněny škrábanci, skvrnami nebo zaschlými pufrovými usazeninami.

Ujistěte se, že uživatele ochráníte před UV zářením

UV transiluminátor NENÍ standardní pozorovací lampa, ale zdroj světla s vysokou intenzitou, který je navržen pro použití v laboratoři.

Přímé nebo nepřímé vystavení UV záření může vést k poškození očí a kůže. Laboratorní bezpečnostní pokyny Stanfordu uvádějí následující opatření pro používání transiluminátoru: mít přístup k transiluminátoru pod kontrolou při jeho používání, držet odrazové plochy mimo dosah transiluminátoru a vyvěsit značení, že je třeba chránit pokožku a oči.

Vždy používejte ochranný vrchní kryt, štít nebo uzavřenou obrazovou skříň, která je součástí přístroje. Laboratorní postupy, které vyžadují práci s gelem, mohou vyžadovat zakrytí obličeje, nošení rukavic, zapnutého laboratorního pláště a pokrytí pokožky UV blokátory.

Nepředpokládejte, že běžné ochranné brýle blokují UV vlnovou délku. Noste vhodné ochranné pomůcky určené pro přístroj a dodržujte pravidla laboratoře ohledně radiační bezpečnosti.

Lepší expozice je dosaženo uzavřeným gelovým dokumentačním systémem s bezpečnostním zámkem, na rozdíl od práce nad otevřenou světelnou krabicí. Některé systémy neumožňují otevírání zobrazovacích dveří při provozu v UV režimu.

Pedagogové by měli zavést konzistentní pracovní postup sledování

Existuje jednoduchá stopa, kterou lze použít k minimalizaci zbytečné variability:

• Elektroforéza a barvení 1. Elektroforéza a 1 barvení.
• Ujistěte se, že mořidlo má správnou vlnovou délku.
• Ujistěte se, že vnější strana gelové misky je čistá a suchá.
• Vyberte požadovanou vlnovou délku a intenzitu UV záření.
• Gel naneste na pozorovací plochu uprostřed.
• Zavřete ochranný štít/zobrazovací kryt.
• Použijte co nejkratší dobu expozice k vytvoření viditelných pásů.
• Vyfoťte s příslušným emisním filtrem.
• Při pohybu gelu UV světlo vypni.
• Po použití povrch otřete.

Pokud se provádí více experimentů, koncentrace skvrny by měla být stejná, stejně jako zobrazovací filtr, doba expozice, nastavení intenzity a podmínky fotoaparátu.

Připojte Transilluminator do zobrazovacího workflow

Pokud uživatel nemusí gel kontrolovat, může být použit stolní transiluminátor. Pro náročnější aplikace je potřeba kompletní gelový dokumentační systém včetně kamery, tmavého krytu, filtrů a softwaru pro analýzu obrazu.

Integrované systémy lze použít pro zachycení obrazu, měření pásu, dokumentaci a běžnou analýzu gelu. Bio-Rad charakterizuje platformy pro gelovou dokumentaci, které mají řízené osvětlení a software pro automatické získávání a analýzu obrazu.

Rozhodnutí bude záviset na tom, co laboratoř s obrazem udělá. Ve výzkumné laboratoři může výuková laboratoř potřebovat jasné vizuální potvrzení, výzkumná laboratoř může potřebovat sledovatelné obrazové soubory, konzistentní expozici a kvantitativní analýzu pásem.

Nikdy neodstraňujte zdroj světla

I když UV lampy vypadají, že jsou zapnuté, časem začnou ztrácet svůj výkon. Při snížené intenzitě operátor prodlouží dobu expozice, což může vést k menší konzistenci a větší expozici vzorku.

Dodržujte pokyny výrobce k údržbě žárovek. UV radiometr by byl objektivnějším měřítkem než vizuální odhad a UVP zjistil, že měření záření je vhodnou metodou pro sledování životnosti UV zdroje.

Vyměňte lampy jako sadu, pokud je doporučeno, důkladně vyčistěte pozorovací filtr a poznamenejte data údržby. Zářivkové UV lampy mohou také obsahovat rtuť a měly by být podle místních požadavků likvidovány a likvidovány jako nebezpečný odpad.

Závěr

Při použití UV transiluminátoru pro gelovou vizualizaci to může být rychlé a jasné, ale nemůže být jasný jen v ultrafialovém světle pro dosažení dobrých výsledků.

Vlnová délka by měla být vhodná pro barvení a následné použití. Osvětlení by mělo být co nejrovnoměrnější, expozice co nejkratší, filtr fotoaparátu by měl být stejný jako vyzařovaná fluorescence a uživatel by měl být chráněn před UV zářením ze zdroje.

Správný přístroj je ten, který zvládne velikost gelu, způsob barvení, požadavky na zobrazovací metodu, pracovní postup pro získání vzorků a bezpečnostní opatření pro laboratorní prostředí.

Často kladené otázky

Otázka 1. UV transiluminátor se používá k čemu?

Primárně se používá k vizualizaci pásů barevně fluorescenčně značené DNA, RNA nebo proteinu v elektroforézních gelech. Může být také začleněn do gelového dokumentačního systému.

Otázka 2. Která z následujících vlnových délek se běžně používá pro DNA gely?

Běžné použití středního UV záření (blízko 302 nm) je pro rutinní sledování gelů. Konečný výběr by měl být podobný barvení i nanášení do dalšího postupu.

Otázka 3. Mutuje UV světlo DNA?

Ano. Dlouhá expozice může způsobit poškození DNA a snížit klonovatelnost DNA a následných aplikací.

Otázka 4. Co je účinnější: Modré nebo UV světlo?

Pokud je obavou UV poškození uživatele a/nebo poškození DNA, doporučuje se použití modrého světla pro kompatibilní barvení. I u některých známých skvrn může UV záření poskytnout lepší excitaci.

Otázka 5. Proč mají gelové pásky slabinu?

To je pravděpodobně způsobeno nízkou koncentrací vzorku, nevhodným barvením, nevhodnou vlnovou délkou nebo filtrem, stárnoucími lampami, příliš vysokým množstvím pozadí nebo špatným barvením.