Receptor vázaný na G protein: Od buněčné signalizace po objev léku

Receptory spojené s G proteiny, zkráceně GPCR, jsou membránové proteiny, které pomáhají buňkám reagovat na signály zvenčí buněk. Tyto signály mohou zahrnovat hormony, neurotransmitery, lipidy, peptidy i světlo.

Ačkoliv existuje jasná společná struktura v sedmi-transmembránové struktuře GPCR, nefungují stejným způsobem. Výsledky experimentu mohou záviset na ligandu receptoru, prostředí buňky, úrovni exprese receptoru a signálních partnerech.

Výzkumníci tedy musí jít dál než jen toto měření "aktivace" receptoru sloučeninou, aby rozluštili biologii GPCR. Důležité jsou všechny dráhy, časování, formát testu, řízení a buněčný model.

Receptor spojený s G proteinem: Co to je?

Počet průchodů typického GPCR přes buněčnou membránu je 7. Extracelulární části se vážou na signální molekuly a intracelulární části na G proteiny, arrestiny, kinázy a další signální molekuly.

GPCR jsou podle průvodce IUPHAR/BPS Pharmacology klasifikovány do několika hlavních tříd, například receptory třídy A, B, C, Frizzled a Adhesion receptory. Třída A je největší a zahrnuje dobře známé cíle, jako jsou adrenergní receptory, dopamin, opioidy a muskarinové receptory.

Ačkoliv jsou strukturou podobné, GPCR jsou schopny rozpoznat velmi rozmanitou sadu signálů. To jim umožňuje zapojit se do smyslového vnímání, kardiovaskulární regulace, metabolismu, imunitních funkcí, nálady, pohybu a mnoha dalších aktivit.

Jak se aktivují GPCR?

Ligand se váže na receptor a způsobuje změnu tvaru receptoru. V důsledku této konformační změny je receptor schopen interagovat s intracelulárním signálním proteinem.

Mnoho GPCR má jako prvního partnera heterotrimerický G protein složený z alfa, beta a gama podjednotek. Aktivace receptorů vede k výměně GDP za GTP v alfa podjednotce. Aktivované složky pak ovlivňují enzymy za nimi, iontové kanály a druhé posly.

Nejoblíbenější rodiny G proteinů jsou:

• G, které obvykle způsobuje zvýšení cyklického AMP
• Běžně používaný název pro cyklický enzym redukující AMP je gi/o.
• Dráha Gq/11, která signalizuje dráhy fosfolipázy C a vápníku
• Proteinové a cytoskeletální odpovědi rodiny Rho lze řídit pomocí G12/13.

Tento učebnicový popis je užitečný, ale čára je vzácná forma signalizace! Jeden receptor může signalizovat přes více G proteinů a optimální přenos signálu se může lišit v závislosti na ligandu a typu buňky. GPCRdb uvádí, že receptory mohou interagovat s G proteiny, GPCR kinázami a arrestiny, což vede ke vzniku různých intracelulárních signálních drah.

Role zatčení

Jakmile je G protein aktivován, signalizace GPCR nepřestává.

GPCR kinázy jsou schopny fosforylovat aktivované receptory. Arrestiny by pak mohly interagovat s receptorem, bránit dalšímu propojení receptoru s G proteiny, usnadňovat internalizaci receptoru a být zapojeny do dalších cest přenosu signálu.

Proto nelze nábor zatčujících považovat za "vypínač". V závislosti na receptoru a experimentu může ovlivnit transport, desenzitizaci, recyklaci, degradaci receptoru nebo modulovat další následné účinky.

Protože jak signalizace G proteinu, tak nábor arrestinu jsou důležitými měřítky kompletní farmakologie sloučeniny, často se měří společně.

Články v této sekci zkoumají způsoby, jakými může stejný receptor vést k různým reakcím

GPCR nejsou jen vypínače zapínání/vypínání.

Různé ligandy se mohou navázat na různé konformační fáze receptoru. Jeden typ ligandu může způsobit vysokou úroveň aktivace na jedné G proteinové dráze, zatímco druhá dráha může způsobit větší nábor arrestinu nebo odlišný signální profil. Obvykle se označuje jako funkční selektivita/zaujatá signalizace.

Pozadí buněk je také důležité. Stejný receptor lze najít ve dvou různých laboratořích, ale obsahuje různé množství G proteinů, arrestinů, kináz, enzymů nebo endogenních receptorů v buňkách.

Dalším problémem může být úroveň exprese receptorů. Nadměrná exprese může zesílit odpovědi na nízkou úroveň aktivity a/nebo změnit preference vazby, a také může vést k tomu, že částečný agonista bude mít v buňce silnější aktivitu než v nativní tkáni.

Výsledek by proto měl být považován za indikaci chování celého experimentálního systému, nikoli pouze receptoru.

Vyberte test na základě biologické otázky

Žádný GPCR test nedokáže odpovědět na všechny otázky.

cAMP Assays

Receptory s Gs nebo Gi proteiny se obvykle měří pomocí cAMP. Gs odpověď může vést ke zvýšení cAMP a Gi odpověď může být indikována inhibicí stimulované produkce cAMP.

Tyto testy se běžně používají ve studiích koncentrace-reakce, při charakterizačních studiích agonistů a ve studiích antagonistů. V experimentech s antagonisty se obvykle aplikuje koncentrace agonisty až po vystavení testovací sloučeniny buňkám.

Kalciové testy

Gq-spřažené receptory lze studovat intracelulárními testy vápníku. Mohou poskytnout rychlý a vysoce propustný výstup, ale odezva může být krátká a silně závisí na manipulaci s buňkami, zatížení barviv, expresi receptorů a době měření.

Vazba GTPγS

Testy GTPγS patří mezi nejranější události měřené v procesu aktivace G proteinu a často se používají k potvrzení aktivity agonisty v membránových přípravách. Protože je test poměrně blízko interakce receptor–G protein, může snížit část zesílení, které se vyskytuje při následných výstupech.

Nábor zatčení

Arrestinové testy lze použít k vyšetřování zkreslení dráh, signálu specifického pro ligand, transportu receptorů a desenzitizace receptorů. Nejlépe se používají společně s testem na G protein, nikoli jako obecný indikátor aktivace receptoru.

Biosenzory živých buněk

Techniky BRET a FRET (a další biosenzorové metody) mohou sledovat signální události v živých buňkách jako funkci času. Největším lákadlem je kinetická informace: vědci dokážou měřit, kdy signalizace začíná, kdy vrcholí a kdy klesá, protože měří více než jeden koncový bod.

Vytvořte přesný experiment s GPCR

Dobrý test je založen na biologikách, ne na přístroji.

Nejprve se ujistěte, že receptor je exprimován a umístěn na správném místě v buněčné membráně. Nízká odpověď nemusí být důsledkem nízké aktivity ligandu, ale špatné exprese/transportu receptorů.

Za druhé, přidejte vhodná řídicí zařízení. Obvykle může být potřeba známý agonista, známý antagonista, kontrola vozidla, netransfekované buňky a receptorově nezávislá kontrola pro následný test.

Nakonec proveďte kompletní křivku koncentrace-odezvy. Hodnocení pouze jedné koncentrace sloučeniny nebude spolehlivým měřítkem účinnosti, účinnosti, částečného agonismu, toxicity nebo nespecifické interference s testem.

Je také potřeba standardizace časování. Jakmile dostanete signál vápníku během několika sekund a pak o pár hodin později změříte expresi genů, nelze tyto dvě věci jednoduše porovnat. Testy měřící stejný receptor lze použít k měření různých fází odpovědi.

Nakonec ověřte významné výsledky pomocí ortogonálního přístupu. Pokud je v cAMP testu zjištěna aktivní sloučenina, je nejlepší ji potvrdit dalším užitečným testem, vazebným testem nebo receptorově specifickým pozitivním kontrolním testem. Manuál pro pokyny k testu naznačuje, že bude doporučeno pečlivé ověření, kontrola kvality a farmakologická charakterizace výsledků GPCR při přechodu k optimalizaci olova.

GPCR pro objevování léčiv

GPCR nadále hrají klíčovou roli při objevování léčiv, protože se podílejí na mnoha aspektech fyziologie a jsou exprimovány na povrchu buňky. GPCRdb odhaduje, že 25 % lidských hormonů je zapojeno do reakce na členy této rodiny receptorů a že přibližně třetina všech léků cílí na členy této rodiny.

U tradičních programů byly hlavními cíli vyhledávání buď agonisté, nebo antagonisty, kteří se vážou na hlavní místo vazby ligandů. V současnosti probíhá také zkoumání allosterických modulátorů, ligandů zkreslených dráhou, selektivity receptor–transducer, kinetiky vazby a návrhu sloučenin založených na struktuře.

S příchodem strukturální biologie se to stalo reálnějším. GPCRdb nyní zahrnuje nástroje pro porovnání vazebných míst a aktivačních stavů GPCR, včetně experimentálně určených struktur receptorů, komplexů receptor–ligand a komplexů receptor–G proteinů.

Sloučenina s dobrou strukturou by měla být podrobena funkčnímu testu i při dobré strukturě. Molekula se může navázat na vhodný cíl s silnou vazebnou afinitou a nespustit zamýšlenou buněčnou odpověď, nebo naopak může molekula aktivovat požadovanou dráhu, ale ne správným způsobem.

Závěr

Receptory spojené s G proteinem je nejlepší chápat nejen jako membránový spínač, ale jako flexibilní signalizační systém.

Receptor mění tvar v reakci na vazbu ligandu, receptor nachází své partnery v buňce a prostředí buňky určuje průběh signálu. Proto je důležité zvážit výběr testů, expresi receptorů, načasování dráhy, kontroly a ortogonální validaci.

Nejlepší závěry pro výzkum GPCR a objevování léků jsou často dosaženy kombinací strukturálních informací a více než jednoho funkčního testu.

Často kladené otázky

Otázka 1. Jaká je hlavní funkce GPCR?

GPCR je receptor na povrchu buňky, který reaguje na extracelulární signál a vyvolává intracelulární odpověď. Odpověď může být prostřednictvím G proteinů, arrestinů, druhých messengerů, iontových kanálů nebo genové regulace.

Otázka 2. Jsou všechny GPCR aktivovány stejným G proteinem?

Ne. Různé receptory mohou preferovat aktivaci různých G proteinů (Gs, Gi/o, Gq/11, G12/13 nebo více signálních partnerů).

Otázka 3. Co je to osiřelá GPCR?

Osiřelý GPCR je receptor, u kterého není jistý přirozený aktivační ligand. Tyto receptory mají stále zásadní význam pro základní výzkum a vývoj léků.

Otázka 4. Takže, který test použít pro screening GPCR?

"Nejlepší" test závisí na otázce, která je řešena, a na signální dráze receptoru. Různé aspekty odpovědi lze měřit pomocí cAMP, vápníku, GTPγS, arrestinu a biosenzorových testů živých buněk.

Otázka 5. Jaký je důvod, proč výzkumníci používají více než jeden test?

Jeden test může měřit pouze jednu dráhu nebo mít specifické interference pro formát. Pokud lze ortogonálním testem prokázat, že pozorovaný efekt je skutečně spojen s receptorem, lze uzavřít, že jde skutečně o účinek receptoru.