Programovatelný ultrazvukový disruptor: Budování opakovatelného workflow sonifikace

Když laboratoř vyžaduje větší kontrolu, než je možné s ručním homogenizátorem, může být řešením programovatelný ultrazvukový disruptor. Může narušit buňky, rozptýlit částice, homogenizovat suspenzie, stříhat nukleové kyseliny nebo připravovat vzorky pro další analýzu.

Nástroj se snadno používá. Výzvou je najít podmínky, které vzorek správně zpracují, aniž by došlo k poškození materiálu, který laboratoř chce získat, a bez přehřívání vzorku.

Právě zde přichází k hodu programovatelné řízení. Operátor může nastavit amplitudu a/nebo dobu zpracování, pulzní cyklus, limitní teplotu nebo celkovou energii bez držení tlačítka a bez posuzování výsledku podle zvuku. Po vytvoření optimalizované metody lze optimalizované podmínky opakovat pro další vzorky.

Jak funguje ultrazvukové narušení

Ultrazvukový disruptor je zařízení, které přeměňuje elektrickou energii na mechanické vibrace. Tyto vibrace jsou předávány sondě, která je konvertorem umístěna do vzorku kapaliny.

Když se sonda pohybuje vysokou rychlostí v kapalině, vznikají změny tlaku, které způsobují tvorbu mikroskopických bublin kapaliny. Tyto bubliny rostou a zmenšují se a nazývají se kavitace. Síly vznikající v místní oblasti mohou způsobit narušení buněčných membrán, rozbití agregátů a umožnit lepší míchání nebo rozptyl.

Z praktického hlediska sonda vyvíjí obrovské množství mechanické energie na malou plochu. Proto může být sondová sonifikace rychlá, ale zároveň škodlivá pro citlivý cíl nebo způsobit pěnu v experimentu.

Proč je programovatelné řízení důležité

Dva vzorky mohou být ošetřeny stejnou dobu, ale nemusí dostat stejnou léčbu.

Pohyb ultrazvukové energie kapalinou bude ovlivněn: objemem vzorku, viskozitou, teplotou, průměrem sondy, hloubkou ponoření a tvarem nádoby. Programovatelný přístroj umožňuje operátorovi ovládat proměnné, které lze realisticky standardizovat.

Moderní ultrazvukové procesory mohou mít nastavitelnou amplitudu, časovaný provoz, pulzní režim, zobrazení energie, nastavení energie a monitorování teploty.

Tyto funkce nejsou jen pohodlné, ale také užitečné. Metodu je snáze dokumentovatelná a přesně vysvětlují, jak byl vzorek zpracován.

Následující: "sonikovaný na jednu minutu." je nedostatečná metoda. Měl by specifikovat typ sondy, nastavení pro amplitudu, pulzní cyklus, celkový čas zpracování, objem vzorku, metodu regulace teploty a typ nádoby.

Použijte počáteční amplitudu, ne maximální výkon

Pravděpodobně největší chybou je myslet si, že více wattů = více výkonu do každého vzorku.

Amplituda je mírou pohybu hrotu sondy a je přímo spojena s intenzitou sonizace. Výkon použitý přístrojem se bude lišit v závislosti na odporu generovaném vzorkem, sondou, viskozitou a provozními podmínkami. Když je třeba metodu reprodukovat, je důležité zachovat stejnou amplitudu, teplotu, viskozitu a objem vzorku, říká Sonics.

Při vytváření metod začněte s mírnou amplitudou a nejdříve nepoužívejte nejvyšší amplitudu. Spusť malý testovací vzorek, podívat se na výsledek a intenzitu procesu zvýšit pouze v případě potřeby.

Nadměrná sonikace může vést k lepšímu narušení buněk, ale také způsobit vyšší teplotu, pěnění, opotřebení sondy a poškození citlivých proteinů nebo buněčných struktur.

Vhodná amplituda tedy závisí na aplikaci. Lyza buněk a/nebo rozptylování nanočástic, příprava organel a/nebo střihání DNA by neměly být očekávané jako stejné.

Řízení tepla pomocí pulzního režimu

Při kontinuální sonikaci lze teplotu vzorku rychle zvýšit. To je důležité při použití proteinů, enzymů, membránových struktur nebo jiných teploměrných materiálů.

Mechanické metody narušení buněk mohou způsobit lokální zahřívání, které může vést k denaturaci nebo agregaci proteinů. Proto je zachování kvality vzorku důležité, pokud má být kvalita proteinu zachována, a proto by měl být vzorek uchováván v chladu.

Pulzní režim je cyklus mezi sonizací a relaxací. Při vypnutém cyklu má vzorek čas vychladnout a usadit se kolem sondy před dalším zábleskem. Přerušovaný provoz je také zmíněn v příručkách k vybavení, aby pomohl snížit hromadění tepla a tím zvýšit konzistenci zpracování.

Pulzní režim neodstraní potřebu regulace teploty. I když jsou trubice malé, mohou se rychle zahřívat, zejména při vysoké amplitudě. Stále může být nutné použít ledovou lázeň, chlazený držák, teplotní sondu nebo programovaný teplotní cutoff.

Ujistěte se, že sonda odpovídá objemu vzorku

Významný vliv má typ použité sondy.

Malý mikrotip shromažďuje energii v malém prvku, který může být na malém místě velmi intenzivní. Čím více výkonu budete mít, tím více materiálu a větší sonda. Jak vyplývá z návodu výrobce, průměr sondy a skutečný objem zpracování jsou silně korelované, ale konečný rozsah hodnot závisí na procesu.

Sonda, která je příliš velká na malý vzorek, může stříkat a/nebo se přehřát. Malý hrot ve velké nádobě může způsobit nerovnoměrné zpracování a zbytečně dlouhou dobu zpracování.

Sonda by měla být dostatečně hluboko, aby efektivně přenášela energii do kapaliny, ale ne tak hluboko, aby nasála příliš mnoho vzduchu do kapalného vzorku. Během vibrací by se neměla dotýkat dna ani boku nádoby.

Důležitý je také tvar nádob. Pokud se k zaostření energie použije úzká nádoba, může ji zaostřit jinak než široká baň a použití jiné trubice nebo nádoby ve stejné studii může výsledek změnit, i když jsou nastavení přístrojů stejná.

Sestavte metodu kolem vzorku – CSTA 2014, sekce 2, 12. ročník, Sekce B, Úkol 3

Obvykle se po několika krátkých pokusech najde spolehlivá metoda sonizace.

Začněte skutečným typem vzorku, velikostí vzorku, koncentrací, pufrem a nádobou určenou pro rutinní analýzy. Musí uchovat vzorek chladný; Vyberte vhodnou sondu. Používejte střední amplitudu a krátké pulzy.

Zkontrolujte výsledky každé zkoušky pomocí metody, která simuluje skutečný cíl. Může to být mikroskopie, výtěžek proteinu, enzymatická aktivita, viskozita a/nebo čištění po centrifugaci. Může zahrnovat měření velikosti částic a/nebo vizuální stabilitu pro disperzi částic.

Nehodnocujte úspěch podle úrovně zákalu nebo průhlednosti vzorku. Ztráta aktivity cílového proteinu mohla nastat ještě před vznikem vzorku.

Po určení přijatelných podmínek je pečlivě zdokumentujte a test opakujte s několika nezávislými vzorky. Neexistuje lepší způsob, jak otestovat spolehlivost metody, než nechat ji opakovat.

Běžné materiály používané v laboratoři

Tento typ programovatelných ultrazvukových disruptorů je široce využíván v následujících oblastech:

• Narušení buněčné stěny bakterií a savců. Rozpad bakteriálních a savčích buněčných stěn.
• Předběžné řezání tkání musí být následováno homogenizací tkání. Tkáně by měly být po předběžném řezání homogenizovány.
• To zahrnuje postupy potřebné k přípravě vzorků proteinů a nukleových kyselin. Příprava vzorku proteinu a nukleových kyselin.
• Stříhání chromatinu pomocí DNA nebo chromatinového střihu. Střihání DNA nebo chromatinu.
• Rozptyl částic a nanočástic.
• Emulgace
• Deagregace
• Extrakce a míchání
• Obtíže při přípravě suspendací. Obtíže při provádění obtížných zavěšení.

Existuje několik různých fyzikálních metod, které lze použít pro lýzu buněk, například sonikace. Nejvhodnější přístup se bude lišit podle typu buňky, velikosti vzorku, následné aplikace a citlivosti materiálu, který má být extrahován.

Pokud je nízkointenzivní zpracování nebo jiná disruptivní technika vhodnější pro jemné organely nebo snadno ničitelné proteiny, použijte tuto techniku.

Existují běžné provozní problémy, kterým byste se měli vyhnout

Pěnění je obvykle způsobeno tím, že sonda je příliš blízko povrchu kapaliny a/nebo je vzorek příliš intenzivně zpracováván. Mírné sestupování sondy, snížení amplitudy nebo změna pulzního cyklu může být užitečné.

Příčiny špatného narušení jsou příliš nízká amplituda, použita nesprávná sonda, příliš mnoho vzorku, vzorek není ponořen do správné hloubky nebo je příliš krátký celkový čas zpracování.

Někdy se změní několik proměnných, aby výsledky byly nekonzistentní. Metoda se může lišit v závislosti na použité trubici, počáteční teplotě vzorku, viskozitě, hloubce proniknutí sondy do vzorku a objemu.

Když je slyšet nebo je podivný mechanický zvuk, neměl by být ignorován. Může to být známka uvolněné sondy, poškozeného hrotu nebo špatné montáže. Přístroj by měl být zastaven a zkontrolován před dalším zpracováním.

Hroty sond jsou také erodovány kavitační erozí. Pokud je povrch poškozen, dochází k přenosu energie a do vzorku lze vložit kovové částice. Sondu často kontrolujte a měňte podle návodu výrobce.

Pracujte bezpečně

Použijte správný stojan a svorku k zajištění měniče, nedělejte nestabilní sestavu.

Ultrazvukové procesory však vydají slyšitelný zvuk a pokyny výrobce doporučují ochranu sluchu při používání. Zvukové pouzdro sníží expozici a také zachová rozstřiky nebo aerosoly.

Správně manipulovat a udržovat biologický materiál a dodržovat laboratorní bezpečnostní postupy. Kontrola hloubky sondy by měla být prováděna tak, aby se minimalizovalo tvorba aerosolů a pěnění. Mezi vzorky opláchněte a dekontaminujte sondu vhodným oplachovacím postupem, který je účinný jak pro sondu, tak pro vzorek.

Závěr

Výsledek je ovlivněn amplitudou, pulzním cyklem, velikostí sondy, objemem vzorku, teplotou, hloubkou vzorku v nádobě a tvarem nádoby. Nejtěžší tempo není dobrý začátek.

Spolehlivý pracovní postup začíná krátkými, dobře kontrolovanými studiemi, poté přechází k řádnému následnému testu k posouzení výsledku a následně se shromažďuje dostatek informací, aby jej mohl zopakovat další operátor.

Často kladené otázky

Otázka 1. K čemu se používá programovatelný ultrazvukový disruptor?

Pro lýzu buněk, homogenizaci, disperzi částic, střihování DNA, emulzi, extrakci a různé aplikace pro zpracování kapalin.

Otázka 2. Lepší vyšší amplituda?

Ne. Zvýšení amplitudy zvýší intenzitu sonikace, ale může vést ke zvýšenému zahřívání, pěnění, opotřebení sondy a poškození vzorku.

Otázka 3. Proč se používá režim Pulse?

Pulzní režim: Období odpočinku mezi ultrazvukovými záblesky. To pomůže snížit hromadění tepla a vrátit materiál zpět kolem sondy.

Otázka 4. Jaká je optimální velikost sondy?

Objem, velikost vzorkové nádoby a požadovaná intenzita zpracování by měly být sondou srovnány. Malé hroty jsou vhodné pro malé objemy a velké sondy pro velké objemy.

Otázka 5. Jak udělat výsledky sonifikace reprodukovatelnými?

Sonda, amplituda, pulzní cyklus, objem, teplota, hloubka ponoření, složení vzorku.