Fluorometrické sady: Praktický průvodce kvantifikací citlivých vzorků

V molekulárních biologických laboratořích lze DNA, RNA nebo protein měřit pomocí fluorometrické sady využívající fluorescenci. Tyto testy jsou založeny na barvivách, která mají vyšší signál při vázání na konkrétní cíl, místo měření celkové UV absorbance. Tato selektivita je výhodná, pokud jsou vzorky zředěné, malého objemu nebo kontaminované jinými látkami, které by mohly narušit měření absorbance.

Kompletní pracovní postup obvykle zahrnuje činidlo pro testy, ředící pufr, standardy, testovací zkumavky nebo testovací desky a fluorometr vhodný pro daný postup. Rozsah testu je klíčový pro dosažení spolehlivých výsledků, stejně jako pro konzistenci přípravy standardů, ochranu před nevhodným světelným vystavením činidl a přesné zaznamenání všech ředění.

Sada fluorometru obsahuje všechny materiály a pomůcky potřebné k měření fluorescence

Většina fluorometrických testovacích sad se skládá z vysoce koncentrovaného fluorescenčního barviva, testovacího pufru a referenčních standardů. V některých sadách jsou také elektronky, protokolové karty nebo nastavení testu specifická pro přístroje.

Chemie barviva bude rozhodujícím faktorem toho, co test změří. Selektivní kvantifikace dsDNA by měla být provedena na dvojvláknové DNA sadě. RNA, jednovláknová DNA a proteinové testy jsou založeny na odlišné vazebné chemii a nejsou zaměnitelné.

Jedním z příkladů je, že komerční sady pro dsDNA mohou obsahovat koncentrované činidlo, ředidící pufr a předředěné DNA standardy. Existují i jiné systémy, které dodávají činidla kompatibilní s jednotrubicovými nebo mikrodeskovými fluorometry s odpovídajícími excitačními a emisními vlnovými délkami.

Někdy je fluorescence lepší než UV absorbance

Odhad koncentrace nukleových kyselin pomocí UV spektrofotometrie je založen na absorpci při 260 nm. Je rychlý a užitečný pro poměry čistoty, ale soli, volné nukleotidy, proteiny, RNA, DNA a další organické sloučeniny mohou vést k absorpcnímu signálu.

Fluorescenční testy jsou vytvořeny tak, aby byly specifičtější pro vybraný analyt. To může být užitečné pro zvýšení přesnosti vzorku s nízkou koncentrací nebo vzorku, který může obsahovat potenciální znečišťující látky. Fluorometrická kvantifikace tak může být citlivější a selektivnější než UV absorpce pro měření specifické DNA, RNA nebo proteinu.

Obě metody lze použít v kombinaci. Fluorescence může být použita k měření koncentrace daného cíle a UV absorbance může poskytnout obecnější měření čistoty.

Vyberte sadu pro analyt a měřicí rozsah.

Existuje několik typů běžných fluorometrických sad, například:

• Vysoce citlivé testy dsDNA
• Širokospektrální testy dsDNA
• RNA testy
• ssDNA testy
• Proteinové testy
• Testy kvality RNA

Nízkokoncentrační extrakty a připravené sekvenační knihovny lze detekovat vysoce citlivým testem. Úzkorozsahové testy jsou lepší pro vzorky s vysokou koncentrací. Vzorky mimo validovaný rozsah bude třeba ředit, jinak mohou být výsledky méně spolehlivé.

Rozsahy kvantifikace mezi sadou s vysokou citlivostí a širokým rozsahem mohou být odlišné a týkat se stejného analytu. Test by proto měl být vybírán na základě očekávané koncentrace, nikoli pouze podle názvu vzorku.

Sada musí být kompatibilní i s fluorometrem. Ověřte kanály excitace a emise, formát trubice/desky, objem vzorku, kalibrační metodu a možnosti programovaného testu. Specifické protokoly lze předprogramovat do některých fluorometrů pro analýzu dsDNA, RNA a ssDNA, jiné lze programovat na míru.

Napište definice pro objem vzorku a propustnost

Malý objem je užitečný, pokud je obtížné získat vzorky nebo je třeba je uchovat pro následné experimenty. V některých stolních fluorometrických systémech je potřeba několik mikrolitrů vzorku, ale obvykle se vzorek vloží do většího objemu pracovního roztoku.

Důležitým faktorem je také propustnost. Pro občasná měření a malé dávky může být vhodný jednotrubkový fluorometr. Nástroj nebo mikrodeskový workflow, který dokáže zpracovat více extrakčních vzorků nebo více sekvenačních knihoven, může být preferován pro laboratoře s více vzorky.

Ne každý nástroj je nejpraktičtější. Dobrý systém by měl minimalizovat opakující se pipetování, usnadnit pravidelnou přípravu a sladit skutečné množství vzorků, které bude laboratoř pravidelně zpracovávat.

Dodržovat konzistentní postup testu

Následuje standardní protokol fluorometrické sady:

• A. Funkční řešení je připraveno. Je nalezeno funkční řešení.
• Stanovení potřebných standardů
• Sčítání každého neznámého vzorku
• Důkladné míchání samplů a standardů dohromady
• Inkubace po stanovenou dobu
• Prevence reakcí při nevhodném vystavení světlu
• Pomocí pravítka k měření šířky a délky mozku.9. Správné měření mozku pomocí pravítka.
• Aplikace ředicích faktorů vzorků

Používejte kalibrované pipety k přípravě a používejte standardy a vzorky stejným způsobem. Pokud je krok pipetování prováděn při nízkém objemu, malá chyba v objemu může výrazně ovlivnit konečnou koncentraci.

Důležitý je také čas potřebný k inkubaci. Odebrání jednoho vzorku na začátku a dalšího výrazně později může způsobit zbytečné odchylky. Některé testy jsou také citlivé na rozdíl teploty mezi standardy a vzorky.

Používejte standardy, blanky a repliky správně

Normy se používají k propojení množství analytu s intenzitou fluorescence. Měly by být důkladně promíchané, správně označené a chráněny před kontaminací.

Když je neznámý vzorek vložen do prázdného materiálu, signál měřený je způsoben činidlem, pufrem, zkumavkou nebo podkladovou vzorkovou maticí. Replikovaná měření jsou užitečná, pokud je vzorek cenný, přesná koncentrace je blízko limitu testu nebo pokud by neočekávaný výsledek ovlivnil nákladný následný proces.

Pokud existují duplicitní údaje, které se neshodují, nepočítajte jednoduše průměr obou hodnot. Ověřte přesnost pipetování, míchání vzorků, přítomnost bublinek, čistotu trubiček, dobu inkubace, teplotu a zvolený rozsah měření.

Muži a ženy mají různé způsoby měření bolesti

Mezi běžné důvody nespolehlivých fluorometrických výsledků patří:

• Výběr nesprávného testu pro cíl
• Výběr nevhodného rozsahu citlivosti
• Nepoužívání správné nádoby pro skladování a přípravu
• Přidávání nekonzistentních objemů vzorků
• Přítomnost kontaminantů ve standardech nebo pracovním roztoku.
• Past na zanechávání bublin v optické dráze.
• Používání poškrábaných nebo nekompatibilních elektronek je zakázáno. Poškrábané nebo nekompatibilní elektronky nejsou povoleny.
• Nadměrná expozice světlocitlivým činidlům
• Nepovažujte za to, že počet buněk ve vzorku se snižuje ředěním.
• Použití zařízení mimo dosah ověřeného zařízení.

Koncentrované vzorky mohou také kontaminovat pipety nebo pracovní plochy a ovlivnit budoucí vzorky s nízkou koncentrací. To je minimalizováno čerstvými hroty, čistými pracovními plochami a racionální sekvencí vzorků.

Připojte měření k workflow v Downstream procesu přetažením do Downstream workflow

Fluorometrické sady se často používají před PCR, qPCR, klonováním, přípravou sekvenační knihovny, elektroforézou, transfekcí a dalšími pracovními postupy zahrnujícími kontrolovaný vstup vzorků.

Kvantifikace je důležitá pro normalizaci vzorků, porovnání výtěžnosti extrakce a získání konzistentního vstupu do reakce. RNA testy (založené na fluorescenci) se aplikují před jinými aplikacemi, jako je RT-PCR a příprava cDNA knihovny; Kvantifikace DNA se používá v různých následných aplikacích, jako je PCR, klonování, transfekce a sekvenování nové generace.

Volba sady by proto měla být přizpůsobena rozhodnutí učiněnému po měření. Při rutinní extrakční kontrole lze použít širokospektrální test a citlivější test pro sekvencování s nízkým vstupem.

Vždy je vhodné uchovávat a zacházet s reagenty

Fluorescenční činidla mohou být citlivá na světlo, teplotu a manipulaci. Skladujte, zahřáte, míchejte a expirujte podle návodu v sadě. Ne všechna fluorescenční barviva lze zmrazit, skladovat při pokojové teplotě nebo vystavovat laboratornímu světlu.

Jasně označte pracovní řešení a nezapomeňte zaznamenat datum jejich vzniku. Než začnete podezřívat, že se původní vzorky změnily, zkontrolujte stáří činidel, historii skladování činidel, standardy, pipety, nastavení přístrojů, teplotu a kompatibilitu trubiček.

Závěr

Fluorometrické sady jsou citlivé a selektivní pro detekci kvantifikace DNA, RNA nebo proteinu, zejména u cenných nebo zředěných vzorků. Spolehlivé měření vyžaduje, aby test byl vhodný pro analyt a koncentrační rozsah, použití vhodného fluorometru, konzistentní přípravu standardů a kontrolu celého procesu.

Není to sada s nejnižším udávaným detekčním limitem, která je nejlepší. Je to taková, která odpovídá typu, průtoku, následné aplikaci a požadavkům na kontrolu kvality laboratoře.

Často kladené otázky

Otázka 1. Jaké jsou aplikace fluorometrické sady?

Existuje několik různých sad pro testování kvality dsDNA, ssDNA, RNA a některých testů RNA. Chemie použité metody screeningu by měla být vhodná pro cíl.

Otázka 2. Které jsou účinnější, fluorometrické sady nebo UV metody?

Mají tendenci být konkrétnější a citlivější na konkrétní analyt. UV absorbance může být stále považována za platnou pro test polofinální čistoty a pro měření celkové čistoty vzorku.

Otázka 3. Kolik vzorku potřebujete?

Objemy se liší pro různé testy a nástroje! Existuje mnoho stolních systémů, které vyžadují pouze pár mikrolitrů původního vzorku.

Otázka 4. Jaké činidlo se používá pro testování DNA RNA?

Obvykle ne selektivně. Při rutinní aplikaci může být vhodné měřit obsah DNA a/nebo RNA, a proto může být test specifický pro jeden ku jedné nebo oběma.

Otázka 5. Co je příčinou rozdílů ve výsledcích z různých replikací?

Tyto chyby jsou často způsobeny chybou pipetování, nedostatečným mícháním, bublinami, kontaminací, teplotou nebo chybou v rozsahu měření.