Systém molekulární biologie: Výběr správné platformy pro gely a bloty

Systém molekulární biologie poskytuje digitalizovaný výstup gelu nebo membrány, který lze prohlížet, kvantifikovat, uchovávat a porovnávat. Lze jej nastavit tak, aby skenovala gely obsahující DNA a RNA, barvené proteinové gely, chemiluminiscenční western bloty, fluorescenční bloty a kolorimetrické vzorky.

Měl by se použít systém, který odpovídá testu, a ne naopak.

Jak funguje systém molekulární biologie?

Standardní zobrazovací systém by zahrnoval světlotěsnou komoru, kameru, objektiv, vzorkovací fázi, zdroje světla pro požadovanou excitaci, filtry, které umožňují propouštět pouze světlo s určitou frekvencí záření, software pro kameru pro záznam obrazu a software pro analýzu snímku.

V případě nukleových gelů přístroj svítí na fluorescenční barvu UV, modré nebo jiné vhodné světlo. Bílé světlo se často používá pro proteinové gely, které jsou viditelné. Světlo produkované v chemiluminiscenčních západních blotech je jejich vlastní tvorbou a pochází chemickou reakcí, takže je potřeba citlivá kamera a tmavá zobrazovací komora, ale ne vysoká intenzita světla na vzorku.

Některé all-in-one platformy umožňují gelovou dokumentaci, kolorimetrické zobrazování, chemiluminiscenci a fluorescenci v jednom krytu. Například bio-Rad poskytuje systémy pro zobrazování nukleových kyselinových a proteinových gelů a chemiluminiscenčních blotů, přičemž systémy lze rozšířit viditelným kanálem, dalekočervenými a blízkoinfračervenými fluorescenčními kanály.

Můžete začít se samply, které používáte

První místo, kde začít, je laboratorní stůl – ne na specifikačním listu!

Pro výukovou laboratoř zaměřenou především na agarózové gely mohou být jediné typy potřebnými pro UV, modré a bílé světlo. Přesná laboratoř na výzkum proteinů vyžaduje jemnou chemiluminiscenci a řadu fluorescenčních kanálů.

Thermo Fisher rozděluje své vizualizační systémy na ty, které poskytují jednoduchou vizualizaci, a ty, které poskytují softwarovou analýzu, stejně jako chemiluminiscenční Western blot a vícekanálové fluorescenční zobrazování. Praktická připomínka: gelový dokumentační systém nemusí být nutně úroveň přístroje jako multimódový molekulární zobrazovač.

Přiřaďte zdroj excitace a filtr k barvivu

Každé fluorescenční barvivo má optimální rozsah vlnových délek pro osvětlení a pro emisi světla. Zobrazovací systém musí být vybaven vhodným zdrojem světla pro excitaci barviva a emisním filtrem, který umožňuje emisním (fluorescenčním) fotonům dosáhnout kamery, zatímco odráží světlo použité k excitaci barviva.

Následují příklady systémů, které mohou obsahovat:

• UV transiluminace
• Modré světelné transiluminace
• Bílá světlo propouštěla
• Bílé světlo odrazilo
• Viditelná fluorescenční excitace
• Blízkoinfračervená fluorescenční excitace

Mezi počtem světelných zdrojů a jeho kvalitou neexistuje žádná korelace. Klíčové je, zda jsou vlnové délky a filtry kompatibilní s barvivami, protilátkami a fluorescenčními štítky, které se v laboratoři již používají.

Před koupí systému zkontrolujte seznam činidel v laboratoři, abyste se ujistili, že je podporován aplikacemi. Mějte prosím na paměti, že ne všechna fluorescenční barviva lze zachytit, protože systém se označuje jako "fluorescenční zobrazovač".

Chemiluminiscence a fluorescence jsou si velmi podobné

Při cheluminiscenčním západním blottingu je světlo generováno chemiluminiscenční reakcí, která je obvykle založena na protilátkovém enzymu a luminiscenčním substrátu. Signál se bude měnit v čase – zobrazovací systém by měl být zahájen v rámci doporučené pracovní doby pro činidlo.

Western blotting prováděný fluorescenční přípravou vyžaduje vnější světlo excitace. Lze jej použít k multiplexování experimentů, takže na stejné membráně lze detekovat více cílů pomocí různých fluorescenčních kanálů.

Chemiluminiscence se obecně používá pro citlivou a rutinní detekci. Když je rozhodující multiplexování, stabilní zachycení signálu nebo kvantitativní porovnání, často se volí fluorescence. Neexistuje jediná nejlepší metoda, protože závisí na požadavcích testu, množství cíle, protilátkách, použitých etiketách a cílech analýzy.

Pokud laboratoř rutinně provádí oba testy, měla by zajistit, že navrhovaný systém umožní provádět testy jak v současné podobě, tak bez nutnosti složitých hardwarových změn.

Při fotografování zvažte dynamický rozsah a sytost

Některá skvrna může mít jeden velmi silný pás a několik slabých pásů. Silné pásmo by mohlo být nasycené, pokud by expozice byla dostatečně dlouhá, aby ukázala slabé signály.

Když je tolik světla, že pixely fotoaparátu už nedokážou zachytit. Po tomto bodě bude zdánlivá čistota zobrazeného pásma zachována, ale úroveň intenzity nebude možné použít pro kvantitativní porovnání.

Dynamický rozsah je rozsah slabých až silných signálů, které je zobrazovací systém schopen zaznamenat na jednom snímku. Větší dynamický rozsah umožňuje snadnější nahrávání slabých a intenzivních pásem, aniž by došlo ke ztrátě informací.

Některé zobrazovací platformy dokážou detekovat nasycené pixely, navrhnout vhodnou expozici nebo použít vícenásobné expozice. Mohou snížit počet pokus-omyl zobrazování, ale nejsou navrženy jako náhrada za dobrý experimentální návrh. I když jsou vzorky přetížené, měly by být během fáze testu stále opraveny a signály protilátek, které jsou příliš silné, by měly být také opraveny.

Používání automatické expozice by se mělo vyhnout

Automatická expozice může být užitečná, pokud se na přístroji střídá více lidí, nebo pokud existují faktory, které by mohly ztížit odhad síly signálu.

Některé systémy získají krátké počáteční expozice a na základě toho navrhnou celkovou expozici. Zdroje světla, zaostření a nastavení aplikace jsou automaticky vybírány ostatními.

To může umožnit rychlejší rutinní zobrazování, ale prosím, zkontrolujte to operátorem. Zkontrolujte, zda ano:

• Poznámka: Saturace je indikována u důležitých pásem.
• Slabé pásy jsou vidět na pozadí
• Celé zorné pole pokrývá kompletní vzorek.
• Pro nejlepší výsledky byl použit správný zobrazovací režim.
• Byl použit potřebný filtr a zásobník
• Následující jsou kvantitativní analýzy a vyžadují expozici obleky:

Automatická nastavení jsou dobrý začátek, ale NE omluva, proč si obrázek neprohlížet.

Ujistěte se, že rozlišení, citlivost a zorné pole jsou správné

Rozlišení je důležité pro obraz zachycený fotoaparátem, ale počet megapixelů není ukazatelem kvality snímku fotoaparátu.

Je také důležité mít užitečný systém, který je dostatečně citlivý, má nízké pozadí, dobrou optiku, je jednotný a má dostatečně široké zorné pole, aby pojmul gely nebo membrány používané v laboratoři.

Pokud jsou chemiluminiscenční signály slabé, bude potřeba velmi citlivá kamera. Čím větší je vzdálenost mezi pásmy, tím menší rozlišení je potřeba; Čím menší je vzdálenost mezi pásmy a tím důležitější je mít rozlišení, a čím menší je prvek ve vzorku, který má být oddělen, tím větší rozlišení je potřeba.

Před nákupem umístěte největší laboratorní gelový zásobník, blot nebo multigelový zásobník na místo vyšetření. Pokud je velký gel rozřezán na několik snímků, je to zbytečné úsilí a srovnání bude obtížnější.

Ujistěte se, že snímky jsou pořizovány konzistentně

Doporučuje se pořizovat snímky za stejných podmínek při porovnávání snímků.

Napište režim snímání, typ světelného zdroje, filtr, expoziční dobu, bin, zaostření, pozici vzorku, nastavení analýzy, pozadí a jakoukoli korekci pozadí. Pokud je to nutné, znovu použijte uložené protokoly.

Pokud používáte barvení nebo odbarvení, ujistěte se, že podmínky jsou stejné pro nukleové kyselinové a proteinové gely. Kontrolovat zatížení kontrolních vzorků, koncentraci protilátek, dobu vzniku substrátu a manipulaci s membránou ve western blotech.

Zobrazovač bude schopen zaznamenat pouze vzorek, do kterého je vložen. Nedokáže vyřešit nerovnoměrný přenos, příliš mnoho pozadí, přetížené pruhy nebo nedostatek specificity protilátek.

Otestujte analytický software

Běžné úkoly by neměly být těžké s programem pro analýzu obrazu a software by neměl zakrývat samotnou produkci výsledku.

Některé šikovné funkce mohou být:

• Detekce jízdních pruhů a pásů
• Odhad molekulární hmotnosti
• Odčítání pozadí
• Měření intenzity pásma
• Varování před saturací
• Normalizace
• Multiplexní kanálový displej
• Anotace obrázků
• Export dat
• Když je uživatel nebo experiment zaznamenán.

Vestavěná analýza je výhodou pro rutinní práci a desktopový software může být vhodnější pro detailní analýzu i pro finální přípravu figurek. Například systémy thermofisher pro zobrazování nabízejí palubní sběr a analýzu a externí softwarové pracovní postupy.

Originální soubor obrázků nechte tak, jak je, dokud to jde. Pro úpravu zobrazeného obrazu by neměla nahrazovat surová data o získávání.

Dbejte na to, abyste přijmout opatření a další kroky, abyste zajistili bezpečnost svých vzorků

Je důležité zajistit odpovídající ochranu, protože přímé nebo odražené ultrafialové světlo vyzařované UV zobrazovacím zařízením může poškodit oči a pokožku. Expozici lze snížit uzavřením zobrazovací komory, což je méně než otevřená UV světelná krabice.

Pokud má být DNA z gelu extrahována, může být pro vhodné nukleové kyseliny lepší použití excitace modrým světlem. Zobrazování bílým světlem eliminuje použití UV záření k pozorování viditelných proteinových skvrn.

Systém by měl být také navržen tak, aby se zabránilo kontaminaci vzorek po vzorku. Myjte vzorkovací misky, co nejdříve odstraňte rozlité vrstvy a dodržujte pokyny výrobce pro čištění filtrů, čoček a zobrazovacích povrchů.

Ujistěte se, že je systém nastaven jako optický přístroj

Molekulární biologický zobrazovač nelze čistit jen občas.

Světelné zdroje se časem opotřebovávají, filtry se mohou poškrábat, vzorkovací misky se mohou zabarvit a prach může ovlivnit kvalitu obrazu. Laboratoře by měly sledovat osvětlení, kontrolovat zásobníky a filtry, provádět zálohy akvizičních protokolů, pečlivě aktualizovat software a vést dokumentaci údržby.

Když kvalita obrazu není dobrá, projděte celý proces a zjistěte, jestli není problém s fotoaparátem nebo zbytkem řetězce. To může být způsobeno skvrnou, vzorkem nebo substrátem, nastavením expozice, zdrojem světla nebo filtrem.

Závěr

Nejužitečnější platforma není vždy ta, která má nejvíce funkcí. Je to ten, který nabízí správné osvětlení, citlivost, dynamický rozsah, software, oblast pro zpracování obrazu a pracovní postup, který ostatní uživatelé dokážou reprodukovat.

Jeho dobré zobrazování začíná už ve fázi přípravy vzorku. Přístroj zaznamenává experiment, ale pokud je příprava testu pečlivě prováděna a sběr se opakuje, pak je obraz (záznam) smysluplný.

Často kladené otázky

Otázka 1. Co může zachytit systém molekulární biologie?

Je schopen zachytit DNA a RNA gely, proteinové gely, chemiluminiscenční western bloty, fluorescenční western bloty a kolorimetrické membrány v závislosti na nastavení.

Otázka 2. Jaký je rozdíl mezi gelovým dokumentačním systémem a Western Blot Imagerem?

Ne vždy. Základní gelový systém může podporovat zobrazování pouze pomocí UV, modrého a bílého světla a západní blot zobrazovače mohou vyžadovat citlivou chemiluminiscenci nebo vícekanálovou fluorescenční detekci.

Otázka 3. Proč je dynamický rozsah důležitý? Proč je dynamický rozsah důležitý?

Široký dynamický rozsah signálů umožní zachytit slabé i silné signály bez přesycení těch nejsilnějších. To platí zejména pro kvantitativní analýzu.

Otázka 4. Lze automatickému expozici věřit?

Může být užitečné určit počáteční expoziční rozsah. Operátor by měl také sledovat další faktory, jako je saturace, pozadí, slabé signály a zobrazovací režim.

Otázka 5. Jaký je nejlepší režim Imaging?

Použitý způsob závisí na vzorku, barvení, označení a cíli analýzy. Zdroj světla, filtr a nastavení fotoaparátu závisí na testu.