Kryoelektronová tomografie (Cryo-ET): Je váš vzorek připraven pro in situ strukturální biologii?

Nejperspektivnější aplikace kryoelektronové tomografie nejsou jen: "Jak vypadá tento protein?", ale také "Jak vypadá tato struktura tam, kde skutečně funguje?"

Tento rozdíl je důležitý. Čistý komplex může také nabídnout dokonalou úroveň strukturálních detailů při eliminaci membrán, sousedních komplexů, buněčné struktury nebo virové struktury důležité pro biologickou otázku. Cryo-ET tuto výzvu řeší jinak, když pořizuje mnoho projekcí vzorku ve vitrině k rekonstrukci 3D objemu.

V současnosti Longlight nabízí Cryo-ET jako in situ strukturální přístup k biologickým sestavám, membránou asociovaným komplexům a virovým systémům jako součást svého Služba kryoelektronové mikroskopie.

Praktická otázka pro sběr dat však zní,

Je biologická otázka opravdu ta, která vyžaduje tomogram?

Nejprve si vezměte biologickou otázku před mikroskopem

Někdy vědci přirovnávají Cryo-ET k analýze jednotlivých částic, což naznačuje, že jedna musí být nadřazena druhé.

Obvykle to není srovnání jablka s jablky.

Kryo-EM s jednou částicí může být přímější cestou k vysoce rozlišující průměrné struktuře, pokud čistý, relativně homogenní makromolekulární komplex dokáže odpovědět na biologickou otázku. Nicméně Cryo-ET se stává velmi atraktivním, pokud je relevantní pozice/orientace, molekulární okolí, membránové prostředí nebo buněčná organizace cíle.

Longlight's průvodce kryo-EM s téměř atomovým rozlišením nabízí určité pozadí k cestě jednotlivých částic; Cryo-ET klade další otázku: co lze vidět, když je biologický kontext zachován?

První fyzikální limit – přístupnost elektronů

Pokud je vzorek biologicky zajímavý, neznamená to nutně, že je elektronově přístupný.

Přímá kryogenní tomografie může být možná pro viry nebo jiné izolované organely, malé buňky a tenké periferní oblasti buněk. Některé in situ postupy zahrnují ztenčování vzorků, což je nezbytné pro užitečné přenosové zobrazování větších eozinukleových buněk, které jsou příliš silné na snímkování.

Jednou z dobře zavedených metod výroby tenkých lamel buněk je frézování pomocí kryofokusovaného iontového paprsku (FIB). Kryo-FIB-frézované eukaryotické buňky byly použity pro in situ studie, aby byly vnitřní struktury přístupné pro tomografii a následnou strukturální analýzu.

Plánování vzorku by nemělo začínat napětím mikroskopu! Mělo by zahrnovat 'odkud' a 'jak' elektronový paprsek dosáhne cíle.

Tilt Series NENÍ hromada fotografií, je to Dose Budget.

Cryo-ET nezískává informace o třetím rozměru z jediné expozice.

Tento exemplář je mnohokrát nakloněn a zachycena je série 2D projekcí. Je to způsobeno citlivostí zmrazených biologických vzorků na záření a projekce musí mít omezený celkový rozpočet elektronové dávky. Efektivní tloušťka, kterou elektrony procházejí, se také zvyšuje při větších úhlech náklonu, což znamená, že může být použitelný menší signál.

V konvenční tomografii není možné dosáhnout úplného získání úhlu ±90° kvůli mechanické geometrii a tloušťce vzorku. Nevzorkovaná informace vytváří dobře známý chybějící klín ve Fourierově prostoru.

Ale více projekcí nemusí nutně znamenat lepší. Je třeba zohlednit vzájemný působ mezi rozsahem náklonu, rozložením dávky, kvalitou zarovnání, stabilitou vzorku a viditelností cíle.

Určete, zda potřebujete tomogram, tedy opakovanou strukturu.

Ne všechny projekty Cryo-ET musí vyvrcholit téměř atomovým molekulárním modelem!

Často samotná tomografie poskytuje odpověď na otázku: Kde se nachází stavba? Co se stane s membránou, když je zdeformovaná? Jak jsou virové složky uspořádány? Které komplexy jsou vedle sebe?

Jiný cíl se zobrazí, když existuje více kopií stejného makromolekulárního komplexu. Opakující se cíle lze extrahovat jako subtomogramy, zarovnávat, klasifikovat a zprůměrovat pro zvýšení strukturálního signálu.

V tomto článku již Longlight podrobně vysvětluje tuto trasu. Klíčová otázka nového projektu je tedy stanovena hned na začátku: Je to unikátní 3D architektura, nebo je dostatek podobných kopií pro průměrování?

Skrytým úzkým hrdlem se může stát lokalizace cíle.

Výběr nejlepší mobilní oblasti může být stejně důležitý jako získání technicky kvalitní nakláněcí svazky.

Předpokládejme, že cíl je pouze malou částí velké buňky. I když máte hezký tomogram ze špatné oblasti, stále jde o špatnou datovou sadu.

Aby mohly být sbírány, měly by tedy zohlednit početnost cíle, přibližnou lokalizaci buněk, její rozpoznatelnou morfologii, informace dostupné o označení a zda je nutná další strategie lokalizace.

Tato biologická mapa může výrazně zlepšit logiku akvizičního plánu pro cíle spojené s membránou, virová shromáždění místa, organely nebo prostorově omezené komplexy.

Plánování datové cesty před sezením:

Když je pořízena tilt-série, projekt Cryo-ET není dokončen.

Snímky je pak nutné zarovnat, rekonstruovat do tomogramů a prozkoumat, hledat cíle a segmentovat, a pokud je to vhodné, převést k extrakci, klasifikaci a průměrování subtomogramů.

Proto by měl být požadovaný výstup stanoven před výběrem.

V současné službě Cryo-EM společnosti Longlight se zaměřujeme na dodávání finálních map hustoty, ale také surových dat a mezizpracovacích souborů. To je užitečné, když chce výzkumník zkontrolovat rozhodnutí o zpracování, provést následnou analýzu v systému nebo se k datové sadě vrátit později.

Match Platform to Stage projektu

Kvalita nástroje by neměla být použita k řešení neurčité vzorkové otázky.

Počáteční screening může naznačit, zda by měla být lepší příprava vzorku, rozložení částic, kvalita ledu a/nebo viditelnost cíle před investicí nákladného sběru.

Longlight dnes oznámil stupňovitou kryo-EM platformu složenou z Talos L120C G2 pro screening, Glacios 2 při 200 kV pro rutinní kryo-EM/tomografii a Titan Krios G4 s 300 kV pro náročné špičkové snímky. Je také propojen s upstream proteinovými workflowy prostřednictvím širšího Aplikace proteinů portfolia, které kombinuje strukturální analýzu se svým portfoliem.

Výzkumné pravidlo je:

Vzorek je připravený, přejděte k dalšímu nástroji, ne proto, že je dostupný.

Toto je závěrečná kontrola projektu Cryo-ET.

Pokud jde o potvrzení vzorku do kryoelektronové tomografie, je třeba zvážit pět otázek:

Je potřeba mít nativní prostorový kontext? Je oblast zájmu v molekule přístupná elektronu? Existuje spolehlivý výhled na cíl? Fuj, jeden tomogram nebo opakované částice? Víte, jaké typy datových produktů budou po získání potřeba?

Jakmile jsou tyto odpovědi rozhodnuty, výběr zařízení a strategie zpracování se výrazně zjednodušují.

Síla kryo-ET spočívá v tom, že uchovává informace, které se během čištění ztratily. To však bude užitečné pouze tehdy, pokud jsou příprava vzorku, zobrazovací strategie a biologická otázka společně navrženy jako jeden projekt.

Výzkumníci mohou konzultujte s Longlightem na in situ konstrukčním projektu poté, co jim popíšete typ vzorku, který budou používat, cílovou lokalitu, typ konstrukce, které chtějí dosáhnout, a následnou analýzu, kterou budou použít.

FAQ

Otázka 1. Kryoelektronová tomografie (Cryo-ET)?

Cryo-ET spočívá v pořízení několika snímků biologického vzorku ve vitrínách z různých úhlů a následné rekonstrukci do 3D tomogramu. Jednou z hlavních výhod je, že uchovává strukturální informace v téměř nativním biologickém prostředí.

Otázka 2. Jaké jsou správné podmínky pro použití Cryo-ET místo jednočásticového kryo-EM?

Uvažujme kryo-ET, pokud je klíčovým faktorem pro výzkumnou otázku poloha buňky, organizace membrány, molekulární sousedé nebo nativní architektura. Když je středem pozornosti purifikovaná částice/průměrná molekulární struktura, SPA je často přímočařejší.

Otázka 3. Mělo by se pro všechny vzorky pro Cryo-ET použít kryo-FIB frézování?

Ne. Je možné přímo zobrazit přirozeně ředlé exempláře. V silnějších oblastech buňky může být nutné ztenčení k vytvoření elektronově průhledné části buňky pro získání tomografie.

Otázka 4. Co chybí v Cryo-ET?

Chybí 3D informace kvůli omezenému úhlovému rozsahu, který lze získat během série naklánění. Může způsobit anizotropii, rekonstrukční artefakty, které je třeba při analýze zohlednit.

Otázka 5. Musí být subtomogramové průměrování prováděno pro každý projekt realizovaný v Cryo-ET?

Ne. Jeden tomogram může postačí k odpovědím na otázky týkající se morfologie nebo prostorové organizace. Hodnota průměrování subtomogramů spočívá v možnosti zarovnání a průměrování několika podobných kopií cíle, pokud jsou k dispozici.