Ultra-rychlý elektroforézní pufr: Rychlejší DNA gely bez ztráty průhlednosti

Ačkoli je elektroforéza pomocí agarózového gelu jednoduchá a spolehlivá, doba věnovaná konvenční elektroforéze je někdy omezujícím faktorem v rušné laboratoři molekulární biologie. Pokud laboratoř denně provádí několik PCR reakcí, restrikčních rozkladů nebo klonování vzorků, může se 30minutový běh stát významným úzkým hrdlem, pokud se denně zpracovává více gelů.

Je formulován ultra-rychlý elektroforézní pufr s nižší iontovou pevností, což snižuje vodivost a proud při dané síle elektrického pole a tím omezuje Jouleovo ohřevání. To umožňuje použití vyšších intenzit pole za ověřených podmínek, čímž se zkracuje doba separace a zároveň zůstává užitečné pásmové rozlišení.

Ultra Fast Elektroforéza Buffer—Co to je?

Ultra rychlý elektroforézní pufr je nízko-iontový elektroforézní pufr, který byl optimalizován pro rychlou separaci fragmentů DNA v agarózových gelech. Dodává ionty potřebné pro elektrickou vodivost a chemické podmínky během migrace.

Iontová pevnost tohoto pufru je nižší než u většiny tradičních pufrů, takže se při daných provozních podmínkách vytváří méně tepla díky proudu. To umožňuje použití vyššího napěťového gradientu v laboratoři a zkracuje dobu provozu.

Longlight's 50x super rychle běžící vyrovnávací paměť je podáván jako koncentrovaný roztok a zkracuje dobu oddělení z obvyklých 30 minut na přibližně 5–10 minut podle doporučených podmínek.

Důvod proč nižší Může iontová síla zlepšit rychlost běhu?

DNA má záporný náboj a migruje směrem k kladné elektrodě v elektrickém poli. Čím vyšší elektrické pole, tím rychleji se DNA pohybuje, i když konvenční pufry mohou při vysokém elektrickém poli produkovat značné teplo.

Přehřátí může způsobit tavení agarózy, což vede k ohýbání pruhů, zakřiveným pásům nebo poškození elektroforézy. Nízko iontový pufr vede k menšímu proudu; generuje se méně tepla, což usnadňuje provoz při vyšším napětí.

To neznamená, že napětí lze zvyšovat neomezeně. Rozměry gelu, hloubka bufferu, konstrukce komory a okolní teplota a kapacita napájení nadále ovlivňují běh.

Will Faster Elektroforéza výsledkem je méně rozlišení?

Pokud jsou pufr, koncentrace agarózy, napětí a vzdálenost běhu vhodné pro vzorek, lze dosáhnout dobré separace rychlým během. Podmínky se obvykle nekontrolují při přenosu metody, což vede k nízkému rozlišení.

Aby se fragmenty mohly oddělit, musí mít dostatečnou migrační vzdálenost, pokud jsou blízké velikostí. Pokud je běh zastaven příliš brzy, mohou být stlačeny, i když se ukáže, že se sledovací barvivo pohnulo, poblíž vrtů.

Je důležité, aby laboratoře rozlišovaly mezi analýzou určenou pro určení přítomnosti či nepřítomnosti a vysoce rozlišovacím analytickým gelem. První může mít kratší dobu gelu, druhá může vyžadovat delší dobu gelu nebo o něco nižší napětí.

Jak připravit 1X pracovní pufr z koncentrátu 50X?

50 X koncentrátu by mělo být ředěno na pracovní roztok 1X. Například pro výrobu 1 L 1X pracovního pufru smíchejte 20 ml 50X koncentrátu s 980 ml destilované nebo demineralizované vody.

Před odlitím nebo naplněním komory dobře protřepte. Pro přípravu agarózového gelu i běžící nádrž použijte stejnou přípravu 1X, abyste zachovali konzistenci vodivosti systému.

Neřeďte pufr pod doporučenou pracovní koncentraci za účelem dalšího snížení proudu. Slabé pufrování a/nebo nekonzistentní pásmové vzory mohou být důsledkem nesprávné koncentrace, což může vést k abnormální migraci.

Co je Správně Napětí nastavit?

Napětí by mělo být určeno efektivní délkou gelu, a ne pouze vybíráno z běžného nastavení napájecího zdroje. Longlight doporučuje použití délky gelu přibližně 25–30 V/cm s rychloběžícím bufferem.

Konečné nastavení by však mělo také zohlednit elektroforézní komoru a typ gelu a teplotu pufru. Konečné napětí by mělo také zohlednit délku gelu, zatížení vzorku, konstrukci komory a teplotu pufru.

Napájecí zdroj musí být stabilní na požadovaném nastavení. To Elektroforézní zdroj EP-600 vyrobená společností Longlight je navržena tak, aby poskytovala stabilní elektroforézní napájení pro laboratoř.

Jaký gel Podmínky Nezměnili jste se?

Pufr nemůže překonat použití nevhodné koncentrace agarózy. Nižší koncentrace agarózy obvykle podporuje fragmenty s vyšší molekulovou hmotností, a čím vyšší koncentrace agarózy, tím lepší je separace menších fragmentů DNA.

Důležitá je také tloušťka gelu. Silné gely mohou trvat déle na barvení a mohou mít více tepla. Čisté vytváření vrtů a nakládání vzorků bez poškození okrajů.

Kompatibilní horizontální komora umožňuje vyrovnat elektrické podmínky. The HE-50 Horizontální gelový systém je kompatibilní s více gelovými systémy a vyznačuje se konstrukcí komory s nízkou spotřebou pufru.

Jaké metody barvení a vizualizace použít pro DNA?

V závislosti na produktu a protokolu může být nukleová kyselina barvena použita během přípravy gelu nebo aplikována až po elektroforéze. Při porovnání rychlého pufru s existující metodou barvení musí být metoda barvení stejná.

Velmi krátké úseky mohou ovlivnit vnímání intenzity barvení, zejména pokud pásy běží krátkou vzdálenost. Je důležité upravit expozici, a proto v důsledku výše uvedeného nekopírovat automatickou expozici z běžného průběhu.

LongLight's RedView Skvrna nukleové kyseliny lze použít k vizualizaci DNA a RNA v agarózových a polyakrylamidových gelech a funguje s běžným zobrazovacím zařízením.

Je to tak? Možné získat DNA po rychlém běhu?

Ano, pokud pufr a barvení nemají vliv na extrakci gelu ani na následné reakce. Podle Longlightu 50X Super Fast Running Buffer neovlivňuje extrakci ani ligaci DNA gelu.

Minimalizujte zbytečné vystavení UV záření a odstraňte co nejmenší gelový kousek pro nejlepší zotavení. Pás by měl být oddělený, aby byl dostatečně odlišný, aby nebyl zahrnut žádný sousední produkt.

Pokud je validace metody určena pro klonování, sekvenování nebo jiný citlivý následný proces, zhodnoťte výtěžnost, čistotu a výkon získané DNA.

Kdy změnit běžící buffer?

Některé pufry lze znovu použít, ale opětovné použití by mělo být kontrolováno, a ne pouze na základě vzhledu. Při opakovaných provozech lze měnit teplotu, rozložení iontů a výkon pufru.

Pokud je migrace zpomalena, pásy nejsou v očekávaném tvaru nebo roztok dojde ke kontaminaci, pufr nahraďte zpět. Dalším důvodem, proč je to vhodná doba pro kontrolu pufru, je vysoká teplota v místnosti a po dvou rychlejších běhech za sebou.

Pokud je vzorek důležitý nebo má nízký vstup, doporučuje se použít čerstvý pracovní pufr, aby se předešlo zbytečné variabilitě.

Jaké jsou správné kroky pro laboratoř k ověření Switche?

Použijte známý DNA ladder a vzorky. Použijte stejnou koncentraci gelu, objem vzorku a metodu barvení na existujícím pufru a ultra-rychlém pufru a spusť je paralelně.

Shoda doby běhu, tvaru pásu, oddělení blízkých fragmentů a konzistence a kvality snímku při migraci. Pokud je v pracovním postupu zapojena extrakce gelu, zhodnoťte výtěžnost gelové extrakce a také jednu následnou reakci.

Po schválení dokumentujte ředění, napěťový gradient, velikost gelu, délku průvodu a způsob, jakým byl gel obarven a kolikrát byl pufr použit. Longlight's Obecné činidlo a spotřební materiály jsou navrženy tak, aby usnadnily běžné aplikace v genomice a molekulární biologii.

Závěr

Ultra rychlý elektroforézní pufr dokáže proměnit analýzu agarózového gelu v rychlou kontrolu kvality. Výhodou je, že umožňuje nižší iontovou pevnost a přesto vyšší použitelnou sílu elektrického pole.

Nicméně všechny aspekty přípravy 1X, sladění gelu a běžícího pufru, koncentrace agarózy a regulace teploty jsou stále klíčové pro zajištění spolehlivých výsledků. Krátká paralelní validace umožňuje laboratořím zkrátit dobu provozu, aniž by se obětovalo interpretovatelné oddělení pásu.

FAQ

Q1. Lze ultra rychlý elektroforézní pufr použít s DNA gelem?

Ano. Navrženo pro rychlou separaci DNA v agarózovém gelu. Uživatelům se doporučuje ověřit kompatibilitu gelové komory, barvení a následného postupu.

Q2. Je 50X buffer připraven k použití?

Ne. Koncentrát 50X musí být před přípravou gelu nebo elektroforézou naředěn na 1X. Přímé použití koncentrátu by vedlo k nadměrně vysoké iontové pevnosti a vodivosti, což by vedlo k nadměrné výrobě proudu a tepla během elektroforézy.

Q3. Používají se stejné buffery pro odlití a pro rozpuštění gelu?

Ano, pro oba se doporučuje stejná várka 1X pracovního pufru. To pomáhá udržet sílu pufru v celém gelovém systému.

Q4. Zahřeje se gel, když se napětí zvýší?

Pokud není dostatečně bufferován, nejsou vhodné podmínky napětí nebo komory. Pro více provozů a/nebo teplé laboratoře sledujte teplotu bufferu.

Q5. Je možné získat DNA z rychlé elektroforetické separace pro ligaci?

Ano, pokud jsou použity vhodné barvení a pufr. Počáteční validace laboratoře by měla zahrnovat výkon obnovy a ligace.