Střih chromatinu: Jak vytvořit reprodukovatelný ChIP workflow

Střih chromatinu je jedním z nejcitlivějších kroků v protokolu ChIP. Příliš velké fragmenty mohou vést ke snížení rozlišení a špatné imunoprecipitaci. Střihování příliš vysoké intenzity může vést k poškození epitopů, DNA-proteinového komplexu a obnovitelného materiálu.

Žádný jediný program nebude fungovat pro všechny vzorky. Odezva chromatinu na ultrazvukovou energii se liší podle typu buňky, fixace, výchozího materiálu a závisí na účinnosti chromatinové lýzy a objemu vzorku. Celý přípravný proces by měl být kontrolován tak, aby bylo dosaženo spolehlivých výsledků, nikoli pouze měnit dobu sonikace.

Co je Střih chromatinu?

Před imunoprecipitací se smyk chromatinu rozkládá křížově propojený chromatin na menší fragmenty DNA – proteiny. Protilátky pak mohou být použity k obohacení chromatinu spojeného s konkrétním transkripčním faktorem, histonovou nebo histonovou modifikací.

Po imunoprecipitaci se křížové vazby obrácejí, DNA se čistí a obohacené oblasti jsou analyzovány qPCR nebo sekvenováním. Longlightovy ChIP-seq řešení poskytují pomoc při studiu interakcí protein–DNA a regulačních míst napříč genomem.

Chromatinové střihování se liší od fragmentace purifikované DNA tím, že nukleozomy, přidružené proteiny a paradehydové křížové vazby mění přístupnost a mechanické vlastnosti DNA.

Proč je Fragment Velikost důležité?

Velké fragmenty snižují polohové rozlišení, protože DNA, která je získána, může být mnohem delší než místo navazování proteinu. Mohou také zvyšovat pozadí, když jsou kolem nich oblasti, které nejsou specifické, ale přesto fyzicky propojené.

Nepředpokládejte, že velmi krátké texty jsou nutně lepší. Nadměrné množství zpracování může vést ke ztrátě výtěžku imunoduprecipitace, ztrátě citlivých epitopů nebo k nevhodnému profilu knihovny.

Optimální velikost fragmentu se bude lišit v závislosti na protokolu ChIP, biologickém cíli, použitých protilátkách a následné analýze. Proto by laboratoře měly stanovit přijatelné rozložení pro svůj vlastní test, nikoli pouze univerzální průměrnou velikost.

A co takhle Střih s křížovým propojením?

Křížové propojení udržuje interakci protein-DNA, zatímco příliš intenzivní křížové propojení může ztížit fragmentaci chromatinu a zakrýt epitopy protilátek. Slabé nebo přechodné interakce mohou být ztraceny kvůli nedostatečné fixaci.

Doba fixace se liší podle typu vzorku, koncentrace činidel, hustoty buněk a cílového proteinu. Ochlazení musí být také jednotné, protože chování vzorků se při dalším křížovém propojení změní.

Pokud vzorek i přes zvýšení akustické energie nadále odolává smyku, nevyřeší to základní problém. Před přijetím agresivnějšího programu je třeba zvážit podmínky propojení a zhasínání.

Proč vstup do buněk a Jsou lýzy důležité?

Nadbytek buněk v malém množství může vytvořit hustý, lepkavý chromatin, který se nepravidelně střiže. Příliš málo výchozího materiálu může zvýšit ztráty při manipulaci a ztížit posouzení kvality chromatinu.

Počet buněk mezi experimenty by měl být vyrovnán. Vzorky tkání vyžadují zvýšenou péči, protože existuje vysoké riziko získání heterogenního lyzátu kvůli extracelulárnímu materiálu, strukturálním rozdílům a neúplné disociaci.

Před sonikací je klíčové efektivní uvolnění jader a chromatinu. Neúplná lýza může vést k přítomnosti neporušených jader nebo shluků buněk, které jsou vystaveny energii jinak než zbytek vzorku.

Jak soustředěný Ultrazvuková technika Pomáhá to zlepšit kontrolu?

Sondovační sonátory se používají tam, kde je energie předávána přímo vzorku. Variabilita a potenciál kontaminace mohou být způsobeny polohou sondy, hloubkou ponoření a technikou operátora.

Fokusovaná ultrazvuková technika se používá k nasměrování akustické energie prostřednictvím spojovacího média do uzavřené vzorkové nádoby. To vede k lépe kontrolovanému prostředí bezkontaktního zpracování.

Ten Ultrazvukový zaměřovač zaměřený na BoFU-100 poskytuje teplotně řízené smyky DNA, RNA a chromatinu. The Systém BoFU-1600 nabízí možnost vícekanálového laboratorního pracovního postupu při zpracování více vzorků.

Jaké parametry je třeba optimalizovat?

Akustická intenzita, pracovní cyklus, doba zpracování, počet cyklů, doba pauzy, objem vzorku a teplota vzorku jsou důležité proměnné.

Během počáteční optimalizace se mění jedna hlavní proměnná po druhé. Když se intenzita, délka trvání a/nebo koncentrace buněk mění současně, může být obtížné určit, zda byl výsledek lepší nebo horší kvůli kterémukoli z těchto způsobů.

Otestujte malou matici podmínek kolem rozumného výchozího bodu a porovnávejte rozložení fragmentů a obnovu DNA

- NE nejsilnější léčba, která vede k nejkratší DNA!

Po výběru programu uložte program s měřením buňky, pufrem, trubicí a objemem vzorku. Bez těchto doprovodných podmínek nelze parametry sonizace spolehlivě reprodukovat.

Proč tomu tak je? Důležité že vzorky mají zůstat chladné?

Ultrazvuková léčba je doprovázena zahříváním a chromatin může být citlivý na teplo. Poškození proteinů, ztráta rozpoznávání protilátek a zvýšená variabilita mohou být faktorem tepla.

Chlazení během celého běhu by mělo být stejné (i během odpočinku mezi běhy). Rychlost pohybu trubic mezi ledovým kbelíkem a přístrojem by neměla ovlivnit teplotu vzorku.

Střih Kvalita Kontrola: Jak?

Po střihu vezměte reprezentativní aliquot. Obrněte příčné články, vyčistěte DNA a zhodnoťte rozložení velikosti fragmentů pomocí elektroforézy agarózového gelu nebo vhodného automatizovaného analyzátoru fragmentů.

Nehodnoťte neošetřený křížově propojený chromatin, jako by šlo o purifikovanou DNA. Zdánlivá velikost může být zavádějící kvůli změně migrace způsobené proteiny a křížovými vazbami.

Většina materiálu by měla být v mezích "akceptovaného" rozsahu laboratoře s malou nebo žádnou velkou populací materiálu s vysokou molekulovou hmotností. Množství získané DNA by mělo být také měřeno, protože dobrý profil není cenný, pokud bylo ztraceno velké množství DNA.

Proč je Nekonzistentní Stříhání chromatinu?

Jsou způsobeny variabilní fixací, nepřesnými počty buněk, neúplnou lýzou, proměnlivým objemem vzorků, proměnlivými typy trubic a teplotním posunem.

Pěnění nebo vzduchové bubliny mohou ovlivnit akustické spojení. Proto je třeba vzorkovací zkumavky naplnit, uzavřít a umístit stejným způsobem. Pro vývoj metod jsou preferovány zkumavky z ověřeného typu/ověřené šarže.

Pokud se výsledky z dávky odchylují, může to znamenat, že existují vlivy na pozici vzorku nebo že načasování přípravy vzorku mohlo být nekonzistentní. Jednoduchý záznam běhu může být užitečný pro zjištění, zda existuje nějaká variace související s biologickými, postupovými postupy nebo přístroji.

Jak by měl být nový typ vzorku optimalizován?

Začněte s malou fixací a akustickou matricí s materiálem reprezentujícím skutečný experiment. Nepoužívejte cenný nebo nenahraditelný vzorek pro počáteční test.

Posuďte distribuci fragmentů, obnovu DNA a výkon imunoprecipitace. Po střihu lze vhodnost chromatinu pro ChIP vyhodnotit pomocí pozitivně kontrolované protilátky a známých cílových lokusů.

Po optimalizaci nastavte kritické parametry v SOP. Pro více informací o soustředěném ultrazvuku pro přípravu chromatinu viz Longlight's Stránka žádosti o ChIP.

Závěr

Nejde jen o ultrazvukovou sílu spolehlivého smyku chromatinu. Různé složky fixace, vstupu buněk, lýzy buněk, geometrie vzorku a akustických a teplotních podmínek musí být všechny kompatibilní.

Optimální metoda zajišťuje správné rozložení fragmentů a udržuje imunoprecipitační výkon a obnovu materiálu. Každá laboratoř je vítána kontaktovat Longlight prostřednictvím kontaktní stránky, aby poskytla informace o typu a šarži svého vzorku a o workflow ChIP, který by chtěla použít, pro podporu vybavení a aplikací.

FAQ

Q1. Proč je potřeba stříhání chromatinu?

Rozbíjí křížově propojený chromatin na menší části pro IP. Použití fragmentů kontrolované velikosti zvýší rozlišení ChIP-qPCR a ChIP-seq.

Q2. Co by se stalo, kdyby byl chromatin podstříhnutý?

Velmi velké kusy mohou způsobit ztrátu rozlišení a zvýšení nespecifického pozadí. Zvažte přehodnocení fixace, lýzy a akustických podmínek před automatickým prodloužením léčby.

Q3. Je možné chromatin přestřihnout?

Ano. Pokud se použije příliš mnoho léčby, bude zotavení narušeno nebo budou poškozeny proteinové epitopy a komplexy DNA–protein. Není vždy dobrý nápad používat kratší fragmenty.

Q4. Musí být chromatin během sonikace uchováván na ledu?

Ano. Zpracování při nízkých teplotách je stabilní, což pomáhá snížit poškození vzorků a proteinů způsobené teplem. Teplota by měla být konstantní mezi vzorky a šaržemi.

Q5. Existuje jeden chromatin-she?aRing program, který je použitelný pro všechny typy buněk?

Obvykle ne. Rozdíl mezi buněčnou strukturou, hustotou chromatinu, fixační odezvou a koncentrací vzorku existuje a nové typy vzorků by měly být podrobeny omezené optimalizaci.