Žádná křížová kontaminace: Vysoce výkonný ultrazvukový přístroj pro laboratorní NGS

Vysoce výkonný ultrazvukový přístroj pro laboratorní pracovní postupy musí současně poskytovat dvě věci: přesnou fragmentaci nukleových kyselin a absolutní integritu vzorku. Křížová kontaminace je náročný problém pro laboratoře molekulární biologie. Při komponování knihoven pro next-gen sekvenování (NGS), střihování chromatinu pro CHIP-Seq nebo extrakci DNA z vzácných klinických vzorků může i nepatrné množství cizí nukleové kyseliny model zničit.

Kontaminující plazmidové sekvence a narušené vektorové genomy v

Játra po genové terapii adeno-asociovaných virů | Přírodní medicína

Význam tohoto problému v pracovních postupech NGS

Technologie sekvenování nové generace revolučně změnily výzkum v genomice a klinické diagnostice. Jejich rychlý technologický pokrok a schopnosti sekvenování zrevolucionalizovaly obor, ale technologie mohou snadno pracovat s DNA získanou z různých míst a citlivost těchto technologií může být jak pozitivní, tak negativní. U technologií NGS mohou i stopové množství nukleové kyseliny vést k falešně pozitivním výsledkům, nejednoznačným výsledkům nebo dokonce k neúspěšným testům.

V roce 2025 publikovaná studie čtyř různých PCR prototokolů z různých evropských center zveřejnila studii, která tvrdila, že detekovala sekvence viru hepatitidy B s pokrytím genomu mezi 48 a 100 procenty v negativních kontrolních vzorcích všech čtyř prototokolů. Nejde o statistickou anomálii, ale o systémové riziko způsobené kontaminací, které tradiční metody přípravy vzorků nedokážou odstranit.

Existuje několik způsobů, jak dojít k křížové kontaminaci, například:

• DNA šířící se vzduchem: Ultrazvuková energie na otevřených cévách může vytvářet DNA kapénkové mlhy a narušovat sousední vzorky.

• Zbytky tekutin na znovupoužitelných sondách: Sonikátory založené na sondách vyžadují fyzické spojení, což činí úplnou dezinfekci mezi jednotlivými běhy náročnou.

• Manipulace s deskami způsobující stříkání: Manuální/automatizované přenosy mohou být příležitostí pro přenos vzorků.

•Přenos na povrch: Nedostatečně vyčištěné pracovní plochy/součástky přístrojů mohou rozšířit kontaminaci na budoucí jízdy.

Tato rizika rostou tam, kde je každý den nutné zpracovat desítky nebo stovky vzorků. Důsledky jsou ještě závažnější v klinických podmínkách, kde křížová kontaminace může vést k falešné diagnóze nebo vyžadovat změnu předepsaných postupů pacienta.

Omezení tradičních metod

Jednou z dobře známých a tradičních technik fragmentace DNA a narušení buněk je ultrazvuková technika založená na sondách. Při této technice se vzorek vloží do nádoby a kovový hrot sondy se ponoří.

Ačkoliv tato metoda získává velkou popularitu, má tendenci způsobovat křížovou kontaminaci vzorkovými sondami. Během zpracování vzorku musí sonda přímo kontaktovat vzorek v nádobě. Aby se zabránilo křížové kontaminaci během zpracování, je třeba řešit křížovou kontaminaci spojenou s probí. Existuje spousta možností, že při zpracování vzorků něco přehlédne, zvlášť u viskóznějších nebo přilnavějších vzorků, což může způsobit křížovou kontaminaci náhodnými vzorky. Je třeba řešit zpracování vzorků asistované sondou. Opotřebované hroty sond mohou uvolňovat částice a způsobovat křížovou kontaminaci vzorků.

Ultrazvuková práce ve vodní lázni přináší odlišné problémy. Vzorky jsou umístěny do plovoucích stojanů uvnitř sdílené vodní lázně. I když sonda nekontaktuje vzorky přímo, koupelová voda cirkuluje mezi nádobami. Když trubice během zpracování uniká nebo praskne, její obsah uniká do vany. Obsah může cirkulovat do sousedních vzorků. Tento proces způsobuje obtížné odhalit křížovou kontaminaci, protože nedochází k fyzickému ani přímému přenosu úniku materiálu.

Jak cílená ultrazvuková technika řeší problém

Vysoce výkonný ultrazvukový přístroj pro laboratorní pracovní postupy využívající cílenou ultrazvukovou technologii mění paradigma kontaminace. Princip je jednoduchý, ale silný: ultrazvukový kontakt poskytuje externí zdroj, ale kontakt probíhá přes kapalinové médium a je přímo do nádoby na vzorek. Vzorek je během zpracovatelského cyklu uložen v plně uzavřené jednorázové nádobě/trubici.

Longlight Technology zaměřený ultrazvukový přístroj BoFU-1600 je navržen kolem tohoto paradigmatu bezkontaktního zpracování. Nástroj využívá soustředěnou akustickou energii ke koncentraci vysokofrekvenčních, krátkovlnných zvukových vln přímo na vzorkovací zónu. Protože není sonda, která by se dotkla vzorku, a není sdílená koupelová voda pro cirkulaci mezi zkumavkami, kontaminační vektory jsou eliminovány dříve, než se mohou objevit.

Zde je, jak bezkontaktní zpracování přináší čistší a spolehlivější výsledky:

•Integrita uzavřených nádob: Vzorky zůstávají od začátku do konce v uzavřených centrifugálních zkumavkách. Neexistuje žádná cesta, po které by cizí DNA mohla vstoupit do reakční nádoby

•Nedochází k tvorbě aerosolů: Protože trubice zůstává uzavřená, ultrazvuková kavitace probíhá v uzavřeném prostředí. Žádné aerosolizované kapky neuniknou, což zajišťuje, že sousední vzorky nebo povrchy zůstanou nekontaminované.

• Žádné přenosy související s probe. Nejsou zde žádné sondovací materiály, protože nejsou žádné sondy na čištění/sterilizaci.

Mezi jednotlivými jízdami jsou nedotčené a každý vzorek je v samostatné zkumavce, takže se materiály nepřenášejí.

Ultrasonický přístroj Covaris S220 Focused Ultrasonicator také využívá technologii, která nevytváří aerosoly a nezahrnuje kontaktní dávkové zpracování, aby zabránil kontaminaci. Přední platformy pro automatizaci pracovních postupů NGS integrují cílenou ultrazvukovou techniku, snižují střihové kroky až na 80 %, zkracují dobu přípravy knihovny NGS o 30 % a snižují riziko kontaminace.

Pragmatický přístup k potřebám současných laboratoří

BoFU-1600 byl vyvinut pomocí technologie, která odpovídá realitě současných genomických laboratoří. Tento systém zahrnuje režim volného zpracování, který umožňuje operátorovi nastavit parametry zpracování nezávisle pro každý z až šestnácti vzorků, a režim dávkového zpracování, který umožňuje operátorovi zpracovávat identické vzorky jedním pohybem.

Vysoce přesný systém řízení teploty udržovaný během ultrazvukové analýzy vzorku výrazně snížil riziko artefaktů, které se vyskytují v odebíraných substrátech díky tepelným regulačním faktorům. Dramatické změny způsobené teplem mohou vytvořit iluzi variability nebo dokonce pravdivých signálů a nakonec vést k zastírání signálů, které výzkumníci hledají. Tyto artefakty mohou vést výzkumníky k nákladným a časově náročným slepým uličkám.

Nástroj je tichý, nepotřebuje zvukovou izolaci a má vestavěný operační systém, který umožňuje autonomní fungování bez externího počítače. Mezi další prvky patří pasivní odvodnění s monitorováním hladiny vody pro prevenci přetečení. Ukládání informací v libovolném okamžiku pomáhá při QC procesech, auditech a přesouvání metod mezi pracovištěmi/laboratořemi.

Reakce na potřeby trhu

Roční růst složených látek (CAGR) od roku 2025 do roku 2031 na globálně zaměřeném trhu s ultrazvukovými přístroji pro řezání DNA činí 5,5 procenta. Očekávané tržby specializovaného ultrazvukového zařízení pro řezání DNA by měly být v letech 2025 a 2031 USD ve výši 530 a 731 milionů USD. To je pro průmysl a komunitu indikační, že metoda přípravy vzorku tradiční přípravy vzorku je zastaralá a nemůže uspokojit potřeby reprodukovatelnosti a standardizace genomiky. Kontrola kontaminace je standardem pro ultrazvukový přístroj, proto se očekává, že potřeba reprodukovatelnosti, přesnosti a technologie řezné DNA bez šíření infekcí poroste s růstem genomiky, precizní medicíny a syntetické biologie.

Závěrečná slova

Laboratorní ultrazvukový přístroj má vyšší ziskovou marži, a proto bude prospět genomickým laboratořím, protože pomáhá při křížové kontaminaci vzorků. Nekontaktní zaměřená ultrazvuková technika řeší kontaminaci u jejího zdroje tím, že uchovává vzorky uzavřené, eliminuje tvorbu aerosolů a zcela odstraňuje fyzické kontaktní cesty. BoFU-1600 od Longlight Technology tuto schopnost poskytuje v kompaktním, tichém a snadno použitelném přístroji, který se bezproblémově integruje do přípravy NGS knihovny, chromatinového střihu, mikrobiální lýzy a FFPE protokolů extrakce nukleových kyselin.

Když se z rovnice odstraní kontaminace, experimentální výsledky se stanou tím, čím měly vždy být: přesným odrazem biologie, kterou studujete, nikoli artefakty vaší metody přípravy vzorku.

FAQ

Otázka: Jakým způsobem může vysoce výkonný ultrazvukový přístroj pro laboratoř zabránit křížové kontaminaci?

Odpověď: Používá se ultrazvuk zaměřený na nekontaktní zařízení. Pro vzorky se používají uzavřené jednorázové zkumavky, které eliminují kontakt sondy, zabraňují aerosolu a eliminují sdílenou koupelovou vodu.

Otázka: Lze BoFU-1600 použít s přípravnými sadami NGS knihovny, které jsou již na trhu?

Odpověď: Rozhodně. Dokáže produkovat fragmenty DNA v rozmezí přibližně 150 bp až 5 kb.

Otázka: Abych mohl spustit BoFU-1600, potřebuji použít externí počítač?

Odpověď: Rozhodně ne. Toto zařízení má vestavěný počítač, což vám dává více volného místa na stole a má přímější využití.

Otázka: Je možné spustit stejnou sérii s různými typy samplů?

Odpověď: Rozhodně. Volný režim zpracování umožňuje zpracovat 1 až 16 vzorků s různými ultrazvukovými parametry pro každý vzorek a je také flexibilní pro různé typy vzorků.

Otázka: Jaký je proces regulace teploty sonikátoru?

Odpověď: Existuje vysoce citlivý subsystém teplotních senzorů.