Funkční validace GPCR: Jak dokázat, že váš purifikovaný protein je stále "živý"

Po značném úsilí investovaném do exprese a čištění membránových proteinů GPCR čelí vědci zásadní otázce: Je purifikovaný receptor stále funkční? U receptorů spřahaných s G proteinem (GPCR) – notoricky křehkých a konformačních komplexů – nestačí samotné vytvoření proteinového pásu na gelu. Funkční ověření je zásadním důkazem, že váš purifikovaný GPCR si zachovává svou biologickou aktivitu. Tento článek zkoumá, jak vědci kontrolují "život" v purifikovaném membránovém proteinu, aby potvrdili jeho připravenost pro strukturální analýzu nebo vývoj léků.

Význam funkční validace pro GPCR

GPCR jsou proteiny s vícestavovou signalizací. Mohou existovat v různých konformačních stavech (neaktivní, aktivní a v různých mezistavech). Detergenty během GPCR Membrane Protein Expression And Purification mohou odstranit nativní lipidy, které mohou destabilizovat receptor, nebo aktivně udržovat receptor v neaktivní konformaci. Dvoufázová funkční validace v podstatě řeší následující:

• Je izolovaný GPCR schopný vázání ligandu?

• Je izolovaný GPCR schopen vazby G-proteinu a/nebo může projít jakoukoli konformační změnou?

V nepřítomnosti těchto ověření bude příprava GPCR, bez ohledu na jeho vysokou výtěžnost, nedostatečná pro kryo-EM, krystalizaci nebo jakoukoli mechanistickou farmakologii.

Historické a současné příklady

Existují dva významné příklady, kdy validace purifikovaných GPCR získala velkou pozornost:

1996 – Kobilka et al. (Gether et al.) – ukázal novým využitím fluorescenčních agonistů, že purifikovaný GPCR, β2-adrenergní receptor, může po začlenění do liposomů zachovat vazbu na ligand a aktivaci G-proteinu. Toto byl první příklad, který stanovil standard pro funkční validaci GPCR po čištění.

2021 – Kato, H.E., et al. (Nature) – ukázal několik vysoce rozlišovacích kryo-EM snímků μ-opioidního receptoru v různých aktivních stavech a že μ-opioidní receptor byl očištěn a funkčně ověřen konformačními nanotělesy, GTPγS a testy ELISA. Jejich studie ukázala, že funkční validace receptoru je zásadní a koreluje s vysoce rozlišujícími kryo-EM studiemi.

Tyto studie potvrzují, že přísné funkční testování je neoddělitelné od úspěšné exprese a čištění membránových proteinů GPCR.

Základní metody, jak dokázat, že váš GPCR je "Živý"

Níže jsou uvedeny nejrozšířenější techniky funkční validace, z nichž každá se zabývá jiným aspektem aktivity GPCR.

1. Testy vazby radioligandu (jak klasické, tak kvantitativní)

• Princip: Co se stane, když jsou čištěné GPCR inkubovány radioaktivním ligandem (agonistou/antagonistou)?

• Co dokazuje: Vazba nám říká, zda je kapsa složená a zda je přístupná.

• Typické údaje: Kd, Bmax

• Omezení: Bez státně specifických ligandů nemůžeme vědět nic o neaktivním/aktivním stavu GPCR.

2. Vazba GTPγS (test aktivace přímého G proteinu)

• Princip: GPCR je čištěn a začleněn do lipidových váčků/nanodisků spolu s heterotrimerními G proteiny. Následně se přidává nehydrolyzující nukleotid [35S]GTPγS. Aktivní GPCR váže GTPγS a G proteiny.

• Co dokazuje: Aktivní G proteiny znamenají, že GPCR se vážou na prvního signálního partnera dráhy, a tím aktivuje první krok signalizační kaskády.

• Nejlepší pro: Je to dobré pro zkoumání mechanismů, které přesahují vazbu na ligand.

3. Konformační senzory založené na nanoBRET a FRET

• Princip: Jeden z GPCR je označen donorovým fluoroforem a je také k dispozici malý, membránou propustný ligand nebo biosenzor (např. nanotěleso), který působí jako akceptor. Konformační změny GPCR budou doprovázeny změnou blízkosti páru dárce/akceptor a výsledným signálem BRET/FRET po přidání agonistů.

• Co dokazuje: Tento test je schopen detekovat konformační změny GPCR mezi neaktivním a aktivním stavem v reálném čase.

• Výhoda: Test BRET/FRET se provádí v detergentu a je vysoce výkonný.

4. Rekonstrukce do liposomů nebo nanodisků

• Jaký je princip? GPCR jsou integrovány do nanodisků nebo liposomů, které obsahují liposomální dvouvrstvé membrány. Dvojvrstvové membrány obsahující liposomální G proteiny jsou v režimu bez buněk.

• Co ukazuje? Pro funkci GPCR je nezbytné lipidové prostředí.

5. Konformačně specifická protilátka nebo vazba nanoniků

• Princip: Pro GPCR použijte buď konformně specifická nanotělesa, nebo protilátky, například použití Nb80 pro β2AR v aktivním nebo neaktivním stavu GPCR.

• Co ukazuje? Receptor je zachycen v určitém aktivním nebo neaktivním funkčním stavu.

• Proč je to důležité? To je důležité při provádění kryo-EM na jedné konformaci.

Validace funkcí v procesu GPCR

Služba GPCR pro expresi a čištění membránových proteinů by měla nabízet funkční validaci jako standard pro kontrolu kvality, zahrnující následující:

Krok 1 – Rozsah a návrh: je stanoven funkční koncový bod (např. vazba, aktivace G proteinu, konformace atd.).

Krok 2 – Vyřazování a čištění. GPCR jsou koexprimovány se stabilizačními složkami.

Krok 3 – Hodnocení kvality. SDS-PAGE, SEC, hmotnostní spektrometrie.

Krok 4 – Funkční hodnocení. Radiologované a GTPγS vazebné testy, FRET atd.

Krok 5 – Následné použití: Příprava na kryo-EM nebo testování na drogy, pokud jsou splněna funkční kritéria.

Co technologie Longlight přináší pro validaci funkčních GPCR

Longlight Technology nabízí kompletní spektrum služeb výzkumu a vývoje membránových proteinů s integrovanou funkční validací. Jejich vývoj platformy Membrane Protein se zaměřuje na náročné cíle GPCR.

Některé výhody jsou:

• Plný rozsah: Odbornost v oblasti exprese a purifikace membránových proteinů GPCR a funkčních studií.

• SBDD Použitelné: Vzorky, které prošly ověřením své konformace, jsou připraveny pro kryo-EM/rentgen.

• Celé: Scoping, exprese, čištění, kryo-EM a všechna zahrnutá data.

• Relevantní strukturální biologie: Funkční validace umožňuje přesná 2D mřížková a 3D data týkající se rekonstrukce.

Co dělají:

• Rozsah a návrh: Určení cíle a stabilizace konstrukce.

• Exprese a čištění: Kritéria kvality jsou splněna podle cíle.

• Vzorek a data pro Cryo-EM: mřížka a vitrifikace.

• Rekonstrukce a distribuce: Strukturální model pro strukturální návrh léků.

*Poznámka: Všechny služby jsou určeny pouze pro výzkumné účely*

Praktické TAkeaways pro Researchers

Při stanovování kritérií pro váš projekt GPCR Membrane Protein Expression And Purification zvažte následující:

• Nepřeskakujte funkční validaci. Nedostatek funkční aktivity nezaručuje, že receptor je neaktivní.

• Navrhněte svůj test s konečným cílem, tj. pro mapování epitopů bude nutné vázání ligandů. GTPγS bude nezbytný pro buněčné signalizování a konformační sondy pro kryo-EM.

• Rekonstrukce lipidů může být zásadní. GPCR mají různou potřebu nativních lipidů pro funkční aktivitu.

• Pozitivní a negativní kontroly jsou nutné. Funkční ověření testu lze provést s již známým agonistou a inverzním agonistou.

Závěr.

Prokázat, že vyčištěný GPCR je funkční, není volitelným doplňkem. Je to jediný způsob, jak propojit expresi a čištění membránových proteinů GPCR cennými biologickými nebo strukturálními daty. V kombinaci s novými technikami (nanoBRET, konformační specifická nanotělesa) lze použít klasické metody (vazba radioligandů, GTPγS) k sebevědomé validaci vzorků. Integrovaná platforma Longlight Technology, integrovaná s funkčním GPCR, je navržena tak, aby tuto potřebu řešila a podporovala kritický krok validace pro následné procesy. Pamatujte, že funkční GPCR je základem spolehlivého objevování léků a strukturální biologie.

Získejte bezplatnou nabídku | Kontaktujte Longlight Technology pro přizpůsobené služby exprese, čištění a funkční validace GPCR.

Často kladené otázky.

Otázka 1. Proč je funkční validace nutná po čištění GPCR?

Odpověď: Funkční validace je klíčová pro určení, zda je receptor schopen vazby na G protein a ligand, a nejen pro ověření, zda má strukturální záhyb.

Otázka 2. Stačí jen provést SDS-PAGE, abych zkontroloval, zda GPCR funguje?

Odpověď: Ne, SDS-PAGE není metoda funkční validace. Kontroluje pouze čistotu GPCR a jeho molekulovou hmotnost.

Otázka 3. Jaká je nejrychlejší metoda, jak funkčně testovat čisté GPCR?

Odpověď: Velmi rychlá a kvantitativní metoda je test vazby radioligandu, který se široce používá k testování skládání receptorů.

Otázka 4. Musí se čištěné GPCR vždy rekonstituovat na lipidy?

Odpověď: Ne. Existuje mnoho GPCR, které vyžadují alespoň nanodisky nebo liposomy, aby byly plně funkčně aktivní, ale některé DGM, tedy systémy na bázi detergentů, udržují GPCR funkční.

Otázka 5. Jaká je metoda, která přímo ukazuje aktivaci G proteinu?

Odpověď: Vazba ligandu na receptor v rekonstituovaném systému a aktivace G proteinu je ukázána v testu vázání GTPγS.