Rychlý elektroforézní buffer: Udělejte z gelu kontrolní bod, ne jen čekací krok

Elektroforéza agarózovým gelem není koncem experimentu.

Častěji je to uprostřed.

Provedete PCR, provedete gel a určíte, zda by měl být produkt PCR čištěn. Strávíte plazmid, podíváte se na pásy a pak se rozhodnete, zda pokračovat. Připravujete vzorky pro sekvenování, používáte další QC gel a rozhodujete se, co dál.

Proto se může zdát čekat na elektroforézu jako velmi dlouhá doba. Nic se neposune po proudu, dokud neuvidíte pásky, i když gel může trvat jen půl hodiny.

Hlavní výhodou pufru rychlé elektroforézy je tedy zkrácení rozhodovací smyčky – nejen urychlení migrace DNA.

Longlight's 50x super rychle běžící vyrovnávací paměť je nízko-iontový elektroforézní pufr s nízkou iontovou pevností, který zajišťuje rychlou separaci DNA. Obvykle dokáže provést běžné oddělení za 5–10 minut, místo 30 minut za doporučených podmínek.

Pokud si nejste jisti gumami, pětiminutový gel za to nestojí.

Samotná rychlost není žádoucí výstup.

Pokud gel nevyjde, pak je to pětiminutový opakovací gel a už to není pětiminutový experiment.

I pro běžné aplikace v molekulární biologii je třeba rozlišit pásma, abychom mohli učinit další rozhodnutí: Byl očekávaný produkt generován v PCR? Existuje takový insert? Jsou vhodné pro získání DNA? Je ještě něco, co byste měl se vzorkem udělat?

Rychle běžící pufr je kompatibilní s koncentracemi agarózy 0,8 %, 1 % a 2 % a v těchto gelech bylo dosaženo jasné separace nukleových kyselinových pásů, uvádí Longlight.

Správným cílem tedy není maximální rychlost migrace.

Je to minimální počet bodů, který stačí k rozhodnutí.

Užitečné napěťové okno je měneno změnami nízkých iontových sil.

Je snadné vidět, že existuje limit pro zvýšení napětí, aby byl běžný gel rychlejší: teplo.

Předvídatelnost migrace a tvaru pásu se může zhoršovat s rostoucím proudem a tepelným zatížením. Rychle běžící pufr naopak řeší problém z jiného úhlu pohledu snížením iontové pevnosti, čímž snižuje tvorbu tepla a umožňuje použití vyššího elektrického pole během separace. Podle Longlightu je délka gelu pracovního pufru 1X přibližně 25–30 V/cm, v závislosti na geometrii elektroforézní nádrže a teplotě prostředí.

Tento rozdíl je důležitý.

"Rychlá elektroforéza" neznamená použití vyššího napětí, dokud se něco nepokazí.

Mělo by to znamenat použití bufferu a operačního okna, které byly navrženy tak, aby spolupracovaly.

1X Buffer je považován za součást metody.

Koncentrovaný materiál se zdá být jednoduchý koncept: zředit a spouštět.

Zde mohou malé laboratorní zkratky také přinést nepotřebné odchylky.

Rychlý pufr dodávaný společností Longlight je dodáván jako koncentrát 50X, který je ředěn 1:50 ve destilované vodě pro vytvoření pracovního roztoku 1X. Společnost nedoporučuje vytvářet různé pufrovací podmínky mezi gelem a nádrží a doporučuje se použít stejnou várku roztoku 1X jak pro gelové odlévání, tak pro elektroforézu. Ředění pod 1X se také nedoporučuje, protože může dojít k abnormální migraci.

Jakmile je rychlý gelový zákrok úspěšný, přidejte ho do operačního postupu.

Vyhněte se tomu, aby to bylo něco, co "každý v laboratoři" "zhruba ví."

Nekopírujte napětí z cizí nádrže!

Bez délky gelu je hodnota napětí neúplná informace.

Je užitečné uvažovat o průběhu v termínech síly pole, protože poměr vzdálenosti k času není stejný u kompaktní elektroforézní komory jako u delšího gelu.

Proto Longlight specifikoval rozsah použití na centimetr gelu. Může také pojmout několik typů zásobníků, jako jsou krátké, dlouhé, široké a větší gely, proto by jedno zapamatované napětí nemělo být jednoduše přenášeno z jednoho zařízení do druhého pomocí HE-50 Horizontální gelový systém.

Začněte ověřením "intenzity pole" a sledujte "skutečný gel".

Teplota, konstrukce nádrže a limity napájení jsou stále předmětem experimentu.

Rychlá elektroforéza, když je rozhodnutí snadné

Ne všechny gely mají stejný účel.

Výzkumníci někdy vyžadují podrobné analytické oddělení. Další vyšetření je jen zjistit, zda je PCR produkt získán přibližně ve správné velikosti.

Druhým je případ, kdy je koncept rychlé elektroforézy obzvlášť užitečný.

Během dne se může objevit mnoho drobných zádrhelů při PCR ověření, klonovém screeningu, kontrolách omezení a mezistupňové kontrole DNA. Tyto kontrolní body mohou být kratší, pokud ano, což znamená, že výzkumníci mohou během jednoho odpoledne učinit řadu experimentálních rozhodnutí místo čekání na opakované konvenční testy.

Tyto rutinní kontroly lze dále zjednodušit použitím připraveného DNA markeru, protože markery Longlight jsou dodávány s nakládacím pufrem a jsou navrženy pro přímé použití v agarózové elektroforéze.

Cílem NENÍ standardizovat každý experiment s elektroforézou.

Je důležité pochopit, které gely jsou skutečně navrženy tak, aby odpovídaly na rychlý dotaz.

Proces úspory času nepokračuje, dokud není připraven další krok.

Představte si, že děláte elektroforézu 8 minut a pak musíte připravovat vše v dalším kroku dalších 20 minut.

Buffer byl rychlý. Pracovní postup nebyl jaký.

Pokud se berou v úvahu okolní kroky, je nejlepší metodou rychlá elektroforéza. Podle Longlightu jeho Super Fast Running Buffer nebude zasahovat do postupů po proudu; Extrakce a ligace DNA gelu lze provádět na DNA získané v pufru Longlight.

Pokud je pro laboratoř omezením i doba přípravy gelu, pak je další možností použít Agarózové prefabrikované gely, které jsou již připraveny k naplnění a nepodléhají tradiční době přípravy gelu.

Právě zde se několik malých úspor času stává skutečnou úsporou času při práci u laboratoře.

Dalším krokem, který zpomalí Gel Gets Faster

Když se jeden krok v laboratorním procesu zrychlí, stane se něco známého.

Najednou si uvědomíte, jak dlouhý bude ten další.

Když je oddělení dokončeno během několika minut, čas potřebný k odstranění gelu, nastavení osvětlení, úpravě expozice, identifikaci žebříku a uložení snímků může být větší procento z celkové doby zpracování.

Díky vestavěnému zpracování obrazu a automatické anotaci markerů je Longlightův GI-200 gelový zobrazovací systém je použitelná pro laboratoře, které hledají aplikace přesahující pouze dobu trvání elektroforézy.

Je proto důležité, aby rychlý buffer nebyl hodnocen zvlášť.

Měřte délku pracovního postupu, od zavedení vzorku až po to, kdy můžete učinit další rozhodnutí o experimentu.

Předložte důkazy, že opětovné používání vody je bezpečné. Předložte důkaz, že opětovné použití vody je bezpečné.

Longlight uvádí, že buffer má dostatek bufferu na to, aby mohl být použit vícekrát, ale ne nekonečně.

Pracovní prostředí se může měnit při elektroforéze za sebou, teplých místnostních podmínkách a při akumulovaném používání. Proto by podle pokynů výrobce měl být běžící buffer čas od času vyměňován, aby byla zajištěna reprodukovatelnost.

Teď je čas na jednoduché laboratorní pravidlo.

Určete, kdy je potřeba buffer vyměnit, místo abyste čekali, až vám "divně vypadající gel" připomene, že je čas ho vyměnit.

Závěrečná kontrola na lavici

Při zvažování použití pufru pro rychlou elektroforézu v rutinním laboratorním použití se ujistěte, že pufr validujete vzorky, které laboratoř používá k zpracování.

Vymyslete vhodné řešení 1X. Sesávání a běh by měly probíhat ve stejném pracovním bufferu. Intenzitu pole zvolíte podle délky gelu a podmínek v nádrži. Sledujte teplotu. Ujistěte se, že vyrobené kapely jsou dostatečné pro rozhodnutí.

Pak změřte něco jiného než čas elektroforézy, něco užitečného:

Načítání vzorku a rozhodnout, co dělat dál?

Právě zde má Rychlá elektroforéza svou roli v laboratoři.

FAQ

Otázka 1. Co znamená rychlá elektroforéza pufr? Co je to pojem "pufr pro rychlou elektroforézu"?

Běžící pufr navržený pro rychlejší separaci nukleových kyselin v agarózových gelech. Verze Longlight je formulována s nízkou iontovou pevností, která umožňuje vyšší sílu pole při snížené tvorbě tepla.

Otázka 2. Jak rychlá může být rychlá elektroforéza? Jak rychlá může být rychlá elektroforéza naopak?

Longlight obvykle dosahuje separačních časů kolem 5–10 minut za doporučených podmínek oproti přibližně 30 minutám u běžných oddělení. Skutečný výkon bude záviset na délce gelu, konstrukci nádrže a provozních podmínkách.

Otázka 3. Jaká je koncentrace běžícího bufferu pro 50X?

Koncentrát se ředí v poměru 1:50 destilovanou vodou, aby vznikl pracovní roztok 1X. Ideálně by se stejná várka 1X měla použít na výrobu gelu a naplnění běžící komory.

Otázka 4. Je potřeba používat pufr při vyšší rychlosti před extrakcí gelu?

Podle Longlightu lze Super Fast Running Buffer použít pro extrakci a ligaci DNA gelu, což umožňuje použití vzorků ve standardních následných aplikacích.

Otázka 5. Lze pufr pro rychlou elektroforézu znovu použít?

Produkt má kapacitu pro opakované použití, ale doporučuje se pravidelně měnit produkt pro zajištění přesnosti a reprodukovatelnosti. Teplota i opakované provozní podmínky by měly být také monitorovány.