Velkoobjemové separace, které zachovávají citlivé biomolekuly

Velkoobjemové separace jsou nezbytné pro výrobu vakcín, genových terapií a rekombinantních proteinů. Přesto podmínky, které umožňují škálování – vysoké průtoky, smykové síly a tlak – často degradují citlivé biomolekuly. Proteiny se denaturují. Fragmenty DNA. Virové vektory ztrácejí účinnost.

Zesílení následného zpracování pomocí magnetické separace

Tradiční separační techniky byly vytvořeny pro malé molekuly. Biologika jsou větší a mnohem citlivější než malé molekuly. Biologika vyžadují separační techniky, aby byla zachována integrita a citlivost biomolekuly, aby byl produkt užitečný. Tento článek ukazuje jednu z mnoha výhod použití magnetického separačního procesu pro biomolekulu tím, že ukazuje citlivost magnetické separace během velkoobjemové separace.

Tradiční metody separace

Když většina inženýrů zvažuje hodnotu biomolekul ztracených po separačním procesu, mluví o účinnosti faktoru vázavého biomolekuly a o obnově eluci. Většina degradace produktu však nastává před výpočtem výtěžků a během fáze separace.

Tradiční metody separace vystavují molekuly během fáze separace mnoha škodlivým fyzikálním a chemickým formám.

• Oddělení membrán a sloupců: Proudy, které oddělují biomolekuly, způsobují skládání, rotaci a přeskupování flexibilních strukturních a polymerních molekul, což způsobuje značnou a někdy nevratnou degradaci.

•Separace ohřevem nebo chlazením: Většina tradičních metod separace vyžaduje cykly ohřevu a ochlazování biomolekul. To vede k destrukci biomolekul a tvorbě agregátů.

• Separace, tedy tlakově poháněná: Mechanický a tečný tok biomolekul vázaných na povrch filtru může způsobit zlom, který je smykový nebo nevratný, jakmile je biomolekula ztracena.

• Separace pomocí elucivních pufrů: Změna chemického prostředí a eluční pufry s nižším (nebo někdy vyšším) pH mohou ovlivnit konformaci biomolekuly.

Dr. Lydia Kisley a její tým z Case Western Reserve University ukázali, že některé komerční separační materiály označené jako "plně pórovité" mají centrální části, které jsou většinou neaktivní. To znamená, že výrobci platí za celou kapacitu, ale dostávají jen malou část potenciálního výkonu. To v kombinaci s prodlouženou dobou zpracování může vést k degradaci biomolekul.

Zesílení následného zpracování pomocí magnetické separace

Při kumulativním užívání vede snížená specifická aktivita, zvýšení agregace biomolekul a snížené konečné výtěžky k nákladnému přepracování.

Proč konvenční metody zpracování Can't Dále se rozvíjet

Laboratorní metody mají mnoho metod separace, které lze použít, a mnohé z nich mohou být v průmyslovém měřítku nepraktické.

Příkladem metody s problémy škálování je použití chromatografických sloupců.

•Zúžený transport cíle: V chromatografii s naplněným lůžkem probíhá vazba prostřednictvím difuze analytu. U biomolekul větších než 100 Da je doba difuze blízko vazebné plochy a významná plocha je vyloučena.

•Ucpání: Aby se zabránilo ucpání v průmyslových kolonách, je předem zabráněno vstupnímu proudu.

• Zvýšená spotřeba bufferu: Průmyslové sloupce vytvářejí velké množství použitého bufferu, což zvyšuje provozní náklady.

•Citlivost na smyk během plnění a provozu: Mechanické síly potřebné k udržení rovnoměrného plnění na dně ve velkém měřítku mohou poškodit samotné biomolekuly, které je kolona určena k čištění.

Výzkumníci Julian Galbusera, Ines Zimmermann a Paula Fraga-García z Technické univerzity v Mnichově zdokumentovali, jak technologie magnetické separace řeší tyto úzká místa. Na rozdíl od standardní chromatografie, kde je stacionární fáze matricí natlačených kuliček prostupených pohyblivou kapalinou, magnetická separace zpracovává vstupní proud přímo tím, že stabilizuje funkcionalizované magnetické částice. To umožňuje zcela obejít difuzní bariéry, které obvykle trápí chromatografii, a to vše při práci ve velkém měřítku a zpracování nejasných lyzátů.

Magnetická alternativa: Jemná, rychlá a škálovatelná

Principy magnetické separace jsou zásadně odlišné. Funkcionalizované magnetické částice cílí na konkrétní molekulární druhy v suspenzi. Aplikace vnějšího magnetického pole zachytí komplexy částic-cíl a umožňuje rutinní vymývání nežádoucích druhů. Komplex částic-cílové látky je během zpracování chráněn před smykovými a tepelnými napětími.

Pro procesy separace s velkým objemem jsou výhody této techniky z hlediska separace citlivých biomolekul několika:

•Není nutná difúze póry: Magnetické částice jsou obvykle neporézní. Tím se obchází pomalý difuzní krok, který omezuje kinetiku vazby všech chromatografických metod. Stojí za zmínku, že velké biomolekuly se vážou přímo na povrch částic.

•Jemné zachycení a uvolnění: Magnetické pole působí měkkou objemovou silou na rozdíl od velmi vysokého tlaku a velmi vysoké hustoty balení, které jsou charakteristické pro kolóny s natlačeným lůžkem. Buňky zůstávají neporušené. Virové vektory si zachovávají infekčnost. Proteinové struktury zůstávají složené.

•Přímé zpracování surových nákladů: Magnetická separace zvládne kalné, částice nabité přívodní proudy bez předfiltrace. Tím se eliminuje jedna nebo více jednotkových operací z vlaku po proudu.

•Minimální spotřeba bufferu: Protože magnetické částice jsou zavěšeny a vytahovány a získávány ve sloupci, lze objem bufferu dramaticky snížit, což snižuje jak náklady, tak dopad na životní prostředí.

Studie z roku 2023 publikovaná v časopise Molecular Therapy—Methods & Clinical Development prokázala praktickou aplikaci tohoto principu. Výzkumníci vyvinuli metodu magnetického zachycení bez filtru pro purifikaci rekombinantního adeno-asociovaného viru (rAAV5) přímo z buněčného lyzátu. Za méně než dvě hodiny dosáhli 63% výnosu z přibližně 5 litrů lyzátu, s třílogaritmickým snížením DNA a proteinů hostitelských buněk, přičemž zcela eliminovali hloubkové filtrace a kolonční chromatografii.

Výkon v reálném světě aVýrobní měřítko

Otázkou pro průmyslové výrobce není, zda magnetická separace funguje v laboratoři – ale zda spolehlivě funguje při výrobních objemech. Důkazy stále narůstají ve prospěch.

•Purifikace proteinů v litrovém měřítku: Výzkum publikovaný v časopise ACS Omega ukázal, že jednostupňový magnetický rybolov může dosáhnout 91% čistoty zeleného fluorescenčního proteinu (GFP) přímo z hrubého lyzátu buněk Escherichia coli v objemech na úrovni litrů, přičemž se používají holé nanočástice oxidu železa vytvořené jednoduchou syntézou koprecipitace.

•Vysokogradientní magnetická separace ve větším měřítku: Mnoho stejných principů vysokogradientní magnetické separace (HGMS), které umožňují laboratorní čištění, se používá při výrobě průmyslových mRNA vakcín. Jedna skupina vytvořila 3D tištěnou, jednorázovou komoru pro oddělení HGMS z materiálu splňujícího USP třídu VI. V tomto případě komora pracovala při průtoku 150 mL za minutu, s retencií přesahující 99,39 %. To znamená, že metody magnetické separace zachovávají účinnost zachycení při průtokových rychlostech používaných při velkoobjemových separacích.

• Aplikace v buněčné terapii: Magnetické separační systémy používané k automatizaci izolace T-buněk dosahují účinnosti přes 85 % a čistoty přesahující 96 %, v měřítku připraveném na cGMP pro výzkum a výrobu, za 70 až 100 minut.

Longlight Technology: Inženýrství fnebo tHe Long Run

Technologie separace který nabízí vysoce objemový kontinuální servis, je inženýrským zaměřením společnosti Longlight Technology.

V oblasti magnetické separace jsou systémy Longlight navrženy tak, aby konzistentně udržovaly jednotnou sílu magnetického pole napříč velkými objemy zachycení – což je jeden z nejdůležitějších požadavků pro poskytování reprodukovatelných výsledků dávku po dávce. Opakovatelnost mezi dávkami při velkoobjemových separacích je to, co regulovaná výrobní prostředí jednoduše netoleruje.

Soubor systémů poskytuje odpovědi na specifické výzvy, které velké objemové zpracování přináší:

• Zachycení magnetických sil vysoce koncentrovaných v celé zóně zachycení: Toto se týká problému nerovnoměrného rozložení klesajícího gradientu magnetického pole, kdy některé částice jsou zachyceny s vysokou účinností a jiné zůstávají. Jsou zajaté a pak uniknou, což snižuje výnos a zvyšuje variabilitu.

• Separační komory (nádoby) schopné efektivního zachycení, protože objem komory se zvyšuje z mírně nad stolní měřítko na výrobní šarži.

•Flexibilita procesů: Systém nemusí provádět žádné významné úpravy, aby vyhověl různým typům magnetických částic, pojiv a provozních postupů.

Za hranicemi kompromisu

Vyvažování biomakerů při volbě účinnosti separace nebo zachování biomolekuly se chýlí ke konci. Technologie, která využívá magnety v provozu, není něco, co by průmysl stále testoval. Jedná se o zavedenou průmyslovou praxi a je podložena různými recenzovanými články. Tyto produkty lze nalézt v zásobách mnoha nepochybných výrobců a dodavatelů v oboru.

V aplikacích, kde je hodnota koncové částice (uzávěr genu, uzávěr m RNA, uzávěr monoklonálních protilátek, buněčné a buněčné produkty atd.) rozlišujícím znakem magnetické separace:

1. Udržuje biologickou aktivitu, která je ztracena při konvenčním separování;

2. Eliminuje několik separačních operací tím, že vyjasní počáteční přívod.

3. Vyžaduje méně pufru a menší kontakt s chemikáliemi.

4.I. je snadno upravitelné z výzkumu a vývoje na plnou výrobní linku.

Vědecký základ je dobře zavedený. Inženýrství je vyspělé. Otázkou nyní není, zda magnetická separace patří do velkoobjemového biozpracování, ale jak rychle ji výrobci přijmou, aby chránili to, na čem záleží – molekuly, které přinášejí terapeutickou hodnotu.

Chcete-li zjistit, jak mohou magnetické separační systémy řešit velké objemové separace ve vašem konkrétním procesu, navštivte www.longlight.com pro technické specifikace a podporu aplikací.

FAQ

Otázka: Lze velké množství nečisených buněčných lyzátů zpracovat magnetickou separací?

Odpověď: Ano. Magnetická separace může být provedena na přívodních proudech s vysokou zákalností a nevyžaduje žádnou předfiltraci přívodního proudu, čímž snižuje počet jednotkových operací.

Otázka: Je pravda, že aktivita proteinů trpí menší degradací při biomagnetické separaci?

Odpověď: Ano. Biomagnetické separační metody nejsou vystaveny vysokému tlaku/rychlosti ani použití silných pufrových systémů k oddělení a obnově biomolekul.

Otázka: Lze magnetickou separaci škálovat z laboratorního na komerční/průmyslové využití?

Odpověď: Ano. Fyzika magnetického zachycení funguje stejným způsobem v mililitrových a stovlitrových systémech libovolného objemu.

Otázka: Jaké biomolekuly lze snadno zpracovávat magnetickou separací ve velkých objemech?

Odpověď: Virové vektory, mRNA, rProteiny, exozomy a buňky atd. Tyto materiály jsou náchylné k mechanickému nebo tepelnému namáhání.